Paper de les Proteïnes Sinàptiques i l'Exocitosi en els processos de Guia Axonal i Migració

Abstract

La guia axonal i la migració són dos processos similars i crucials per al desenvolupament. Aquests dos elements permeten el correcte posicionament cel•lular i la selecció de dianes essencial per a la funcionalitat posterior del sistema nerviós central, i es fonamenten en la regulació de l’avanç del con de creixement o la cèl•lula, respectivament, en resposta a estímuls externs, quimioatraients i quimiorepulsius, proporcionats per molècules de guia. Un altre component clau del funcionament neuronal és l’exocitosi, que permet la propagació dels estímuls nerviosos entre cèl•lules a través de la fusió de vesícules amb la membrana plasmàtica i l’alliberament de neurotransmissors. L’exocitosi està vehiculada per les proteïnes SNARE, que es troben a la membrana cel•lular i de la vesícula i que, a través de la unió paral•lela dels dominis catalítics, aproximen les membranes plasmàtica i vesicular possibilitant-ne la fusió Malgrat posseir la maquinària necessària per a l’exocitosi, les neurones en desenvolupament no presenten estructures especialitzades per a la transmissió del senyal com són les sinapsis, i es creu que el paper de les proteïnes del complex SNARE rau en el manteniment de la homeòstasi de membrana. Conceptualment, és fàcil pensar que la guia axonal i la migració actuïn a través del control precís de la dinàmica de la membrana, augmentant localment la superfície de la neurona i expandint-la en la direcció del creixement. En aquesta tesi hem investigat el paper de la dinàmica de membrana en la guia axonal i la migració. Concretament, ens hem centrat en l’estudi de la interacció del receptor de la Netrina-1 amb les proteïnes del complex SNARE en dos sistemes bàsics per a l’establiment de connexions del cervell: la guia dels axons de neurones de l’hipocamp i la migració de les neurones del llavi ròmbic atrets cap a una font de Netrina-1. També hem estudiat l’efecte del silenciament de les proteïnes del complex SNARE en dos paradigmes de guia axonal in vivo: la navegació dels axons de les cèl•lules comissurals de la medul•la espinal cap a, a través i més enllà de la línia mitja, i la innervació de l’extremitat inferior per part de les motoneurones d’embrions de pollastre. El tercer focus d’atenció ha estat l’estudi de la dinàmica de membrana i l’exocitosi al con de creixement de neurones d’hipocamp murí en resposta a estímuls quimioatraients de Netrina-1. Els resultats obtinguts durant aquesta tesi han demostrat que el receptor de la atractiu de la Netrina-1 DCC interacciona in vivo amb les proteïnes del complex SNARE Sintaxina1 i TI-VAMP, però no amb SNAP25 o VAMP2 en cèl•lules d’hipocamp i neurones migrants del llavi ròmbic inferior. A més, la interacció de DCC amb Sintaxina1 està regulada pel lligand, però l’exocitosi del receptor de Netrina-1 no es veu afectada per tractaments amb toxines que proteolitzen Sintaxina1. Hem descrit que les proteïnes del complex SNARE són imprescindibles per a la guia dels axons de neurones comissurals i motoneurones , perquè el silenciament de Sintaxina1, SNAP25, VAMP2 o TI-VAMP causa defectes en la navegació dels seus axons compatibles amb alteracions de diversos sistemes (molècula guia-receptor) de guia axonal. Per últim, hem descrit la dinàmica de membrana i l’exocitosi a nivell del con de creixement amb una tècnica innovadora, que permet la monitorització de l’exocitosi en temps real, i, i hem descrit com la Netrina-1 incrementa l’exocitosi dependent de proteïnes SNARE a nivell del con de creixement i les vies de senyalització que hi estan implicades.

Role of Synaptic Proteins and Exocytosis in Axon Guidance and Migration.

Axon guidance and migration are two similar processes which are key to the development of the nervous system by allowing the correct localization and innervation of neurons. They regulate the elongation of the axon and the movement of cells by the use of guidance molecules which act as chemoattractants or chemorepellents at short and long ranges. A second crucial component in the nervous system functionality is exocytosis. It allows the communication of neighboring cells by the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane and the release of the vesicle contents to the extracellular space, a process mediated by the SNARE proteins. SNARE proteins located at the vesicle and the plasma membranes interact and bring the two membranes into close apposition, thereby facilitation fusion. Developing neurons have a vast array of synaptic proteins whose function is thought to reside in the regulation of membrane homeostasis. It is plausible to think that axon guidance and migration may act thru the precise control of membrane dynamics at discrete locations of the growth cone/leading edge, thereby expanding the neuron on the direction of growth. In this thesis we have analyzed the role of SNARE-mediated exocytosis in axon guidance and migration. We have focused our studies in the analysis of the interaction between the guidance receptor DCC and SNARE proteins in the attraction of hippocampal axons and migrating neurons of the lower rhombic lip towards a Netrin-1 source. We have also studied the role of SNARE proteins in two axon guidance paradigms such as the navigation of commissural axons of the spinal cord and motoneurons. Furthermore, we have also investigated Netrin-1-induced exocytosis in growth cones using live imaging techniques. Our results demonstrate the necessary participation of SNARE proteins and SNARE-mediated exocytosis in axon guidance and migration; reveal a ligand-regulated interaction between the Netrin-1 receptor DCC and the SNAREs Syntaxin1 and TI-VAMP; and show that Netrin-1 triggers SNARE-mediated exocytosis in the growth cone.