Novel Specific Receptor‐based Techniques for Antibiotic Residue Analysis

Abstract

The indiscriminate and/or improper use of veterinary drugs is the cause of potential adverse health effects due to the risk of entering into the food chain and the appearance of residues in food products of animal origin. Moreover, in the case of antibiotics, this fact has been identified as one of the causes for the appearance of antimicrobial resistance mechanisms in bacteria causing human diseases, which is the cause of a big concern within the health authorities, distinct governmental agencies and the society in general. There is an increased need to ensure safety and quality of the foodstuff and customers have also started to become more exigent forcing the industry to introduce consumer worries in their daily procedures, in terms of getting more natural, ecological and healthy products with a clear traceable origin of the ingredients.

Nowadays, food control is performed on centralized laboratories that in most cases use very reliable procedures, but involving expensive equipment, specialized personnel and time consuming sample treatment procedures. In order to drastically improve this situation, the European Commission (EC) and the member state agencies are strongly supporting research activities aimed to increase the efficiency of the actual analytical methods. An strategy is to take advantage of the latest bio-micro-nanotechnological advances and of the complementary skills of multidisciplinary research teams to develop more rapid, sensitive and specific methodologies capable of detecting a wide variety of chemical, biological or any other health risk associated to the agrofood industry and along to the whole food chain.

This thesis describes the research performed in respect to the possibility to develop improved alternatives for food residue analysis based on the combination of selective receptors and novel micro/nanotechnologies. Particularly, the final objective of this thesis was addressed to the development of a multiplexed sensor device to detect inappropriate farm practices and or the contamination of food products by antibiotic residues, mainly milk. In this respect, production of selective receptors with a broad recognition of the most important antibiotic families used in the veterinary field has been one of the most important aims of this research work. Thus, we report here the investigation made regarding development of synthetic receptors for sulfonamide antibiotics (SAs), particularly molecular imprinted polymers (MIPs), and their evaluation of a rational approach. Moreover, production of generic (or class-selective) antibodies for SAs and tetracycline antibiotics (TCs) has also been approached through the rational design and synthesis of appropriate haptens. Evaluation of the features of the antibodies produced has been accomplished through the development of microplate-based ELISAs (enzymelinked immunosorbent assays). The results show that although it has been possible to obtain class-selective antibodies for SAs (up to 11 congeners can be detected), the approach followed for the case of the TCs afforded antibodies with a high selectivity versus TCs possessing an alkyl/alkene group at position 6 of the C-ring, but lacking the hydroxyl group at this position. The necessary protocols to apply these immunochemical procedures to the analysis of milk and hair samples have been established showing that determination of these antibiotics according to the EC regulations was possible for the case of milk. For the case of hair, no regulations do exist at the moment. However this matrix holds great value regarding their potential use to trace inappropriate treatments through the life of the farm animals. The immunoreagents and immunochemical procedures established have been implemented on an optical sensor device developed by the Centre Suisse for Electronics and Microelectronics Inc. (CSEM, Neuchâtel - Switzerland). This device is based on the evanescent wave principle using a particular technological design based on waveguide grating couplers and it is very sensitive to the changes in the refractive index produced at the surface of the transducer. Moreover, the chip developed by CSEM has 24 sensing pads which allow multiple measurements with the same transducer. As a consequence of this collaboration it has been possible to develop a biosensor device able to detect SA residues in milk samples in compliance with the EC regulations. Further investigation, has led to the development of a multiplexed biosensor device by combining immunoreagents (SAs and fluoroquinolone antibiotics (FQs)) produced at the Applied Molecular Receptors group (AMRg) of the CSIC, with bioreceptors (ß lactam antibiotics (BLs) and TCs) provided by UNISENSOR S.A. (Liege - Belgium). The results obtained were very good. About 34 antibiotics from four different antibiotic families can be detected in milk samples following all the EC regulations with the device developed. Before, a multianalyte microplate-based ELISA had been developed combining the same bioreagents to evaluate performance and to establish the most appropriate immunochemical procedures. The immunochemical methods developed within this thesis, including immunoassays and immunosensors, have been preliminarily evaluated in collaboration with the Nestlé Research Centre (NRC), at Lausanne in Switzerland, in order to demonstrate performance in real milk samples.

El uso indiscriminado y/o inadecuado de medicamentos veterinarios es la causa de posibles efectos adversos para la salud por el riesgo que entren en la cadena alimentaria y la aparición de sus residuos en los productos alimenticios de origen animal. Además, en el caso de los antibióticos, este hecho ha sido identificado como una de las causas de la aparición de mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en las bacterias que causan enfermedades humanas, lo cual es causa de una gran preocupación en las autoridades sanitarias, distintos organismos gubernamentales y de la sociedad en general. Actualmente, existe una creciente necesidad de garantizar la seguridad y calidad de los productos alimenticios y los consumidores también han comenzado a ser más exigentes obligando a la industria a introducir sus preocupaciones en sus procedimientos, en términos de conseguir los productos más naturales, ecológicos y saludables con un origen de los ingredientes rastreable.

Hoy en día, el control de alimentos se realiza en laboratorios centralizados que en la mayoría de casos utilizan procedimientos muy fiables, pero necesitan equipos caros, personal especializado y elevados tiempos de tratamiento de muestra. Con el fin de mejorar drásticamente esta situación, la Comisión Europea (CE) y los organismos de los Estados Miembros apoyan firmemente actividades de investigación orientadas a aumentar la eficiencia de los métodos de análisis actuales. Una estrategia es tomar ventaja de los últimos avances en las biomicro-nanotecnologías y de las capacidades complementarias de los equipos de investigación multidisciplinarios para desarrollar metodologías más rápidas, sensibles y específicas capaces de detectar una amplia variedad de sustancias químicas, biológicas o cualquier otro riesgo para la salud asociado a la industria agroalimentaria, a lo largo de toda la cadena alimentaria.

En esta tesis se describe la investigación llevada a cabo en relación a la posibilidad de desarrollar alternativas más adecuadas para el análisis de residuos de alimentos basados en la combinación de receptores selectivos y las nuevas micro/nanotecnologías. En particular, el objetivo final de esta tesis fue dirigido hacia el desarrollo de un dispositivo sensor multiplexado para detectar prácticas agrícolas inadecuadas y/o la contaminación de alimentos, principalmente la leche, por residuos de antibióticos. A este respecto, la producción de receptores selectivos con un amplio reconocimiento de las familias de antibióticos más importantes que se utilizan en el sector veterinario ha sido uno de los objetivos más importantes de este trabajo de investigación. Así, lo constata la investigación realizada en relación con el desarrollo de receptores sintéticos para antibióticos de sulfonamida (SA), polímeros de huella molecular (MIPs), y su evaluación como enfoque racional para otros contaminantes. Además, la producción de anticuerpos genéricos (o selectivos de clase) para SAs y antibióticos de tetraciclina (TC) también ha sido abordada mediante el diseño racional y síntesis de haptenos. La evaluación de las características de los anticuerpos producidos se ha logrado mediante el desarrollo de ELISAs (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) en microplacas. Los resultados muestran que a pesar de que ha sido posible obtener anticuerpos selectivos de clase para las SA (hasta 11 congéneres pueden ser detectados), el enfoque adoptado para el caso de los anticuerpos TCs ofrece una alta selectividad frente a TC que poseen un grupo alquilo/alqueno en la posición 6 del anillo C, pero que carecen del grupo hidroxilo en esta posición. Los protocolos necesarios para aplicar estos procedimientos inmunoquímicos para el análisis de muestras de leche y el cabello han sido establecidos mostrando que fue posible la determinación de estos antibióticos en leche de acuerdo con la normativa de la CE. Para el caso del cabello, no existen regulaciones por el momento. Sin embargo, esta matriz tiene un gran valor en cuanto a su uso potencial para seguir tratamientos inadecuados a lo largo de la vida de los animales de granja. Los inmunoreactivos y procedimientos inmunoquímicos establecidos se han implementado en un dispositivo sensor óptico desarrollado por el Centre Suisse de Electrónica y Microelectrónica Inc. (CSEM, Neuchâtel - Suiza). Este dispositivo se basa en el principio de onda evanescente usando un diseño tecnológico particular basado en acopladores de rejilla de guía de ondas que es muy sensible a los cambios en el índice de refracción producida en la superficie del transductor. Además, el chip desarrollado por CSEM tiene 24 zonas de detección que permiten múltiples mediciones con el mismo transductor. Como consecuencia de esta colaboración ha sido posible desarrollar un dispositivo biosensor capaz de detectar residuos de SA en muestras de leche en el cumplimiento de la normativa CE. Investigaciones posteriores, han llevado al desarrollo de un dispositivo biosensor multiplexado que combina inmunoreactivos (antibióticos SAS y fluoroquinolonas (FQs)) producidos en el grupo de Receptores Moleculares Aplicados (AMRg) del CSIC, con bioreceptores (ß-lactámicos (BLs) y TCs) proporcionados por Unisensor SA (Lieja - Bélgica). Los resultados obtenidos fueron muy buenos. Alrededor de 34 antibióticos de cuatro familias diferentes de antibióticos pueden ser detectados en muestras de leche siguiendo todas las normativas de la CE con el dispositivo desarrollado. Anteriormente, se desarrolló un ELISA multianalito (en microplacas) mediante la combinación de los mismos bioreactivos para evaluar el sus características y establecer los procedimientos inmunoquímicos más adecuados. Los métodos inmunoquímicos desarrollados en esta tesis, incluyendo los inmunoensayos e inmunosensores, han sido evaluados en colaboración con el Centro de Investigación de Nestlé (NRC), en Lausana, en Suiza, con el fin de demostrar su rendimiento en las muestras de leche real.