Estratègies de millora de la potència antitumoral dels adenovirus oncolítics basades en l’increment de l’alliberament viral i l’extravasació vascular

Abstract

La viroteràpia amb adenovirus oncolítics es basa en la lisi selectiva de la cèl•lula tumoral a través de la replicació viral. Les principals limitacions d’aquesta teràpia són: la limitada arribada del virus al tumor després de l’administració sistèmica, la baixa dispersió intratumoral i la resposta immune antiviral. En aquesta tesi hem presentat estratègies per millorar la disseminació intratumoral basades en l’augment de l’alliberament viral i en la millora de l’extravasació i penetració del virus al parènquima tumoral, augmentant en els dos casos l’eficàcia antitumoral. Una de les principals barreres a la dispersió intratumoral són els fibroblasts que infiltren el tumor, i que reben el nom de fibroblasts associats a tumor o CAFs. Els CAFs presenten un fenotip tumorigènic i a més no són permissius a la replicació viral. Amb l’objectiu de superar aquesta barrera vam dur a terme un procés de bioselecció a partir d’un estoc d’adenovirus salvatge mutagenitzat. Després de vàries rondes de replicació en CAFs vam aïllar varis mutants que presentaven un alliberament viral incrementat en aquestes cèl•lules. Vam escollir el mutant que presentava el millor fenotip i vam identificar la mutació responsable del seu fenotip a partir de la seqüenciació del genoma complet i del mapatge funcional. La mutació responsable del fenotip és la mutació iLG397T que provoca la truncació de l’extrem C-terminal de la proteïna i-leader de l’adenovirus. Aquest mutant presenta un alliberament viral i una citotoxicitat incrementades en CAFs, fibroblasts normals i un panell de línies cel•lulars tumorals. La truncació de la proteïna i-leader augmenta l’eficàcia antitumoral de l’adenovirus en models de tumors subcutanis en ratolins immunodeficients establerts a partir de cèl•lules tumorals i de mescles de cèl•lules tumorals i fibroblasts, sense afectar a la toxicitat hepàtica i hematològica. Amb l’objectiu d’augmentar encara més la potència oncolítica de l’adenovirus vam combinar la mutació iLG397T amb la mutació E3/19K-445A aïllada prèviament pel nostre grup i que també augmenta l’alliberament viral. El virus amb les dues mutacions presentava un alliberament incrementat però perdia producció de la progènie viral. Per augmentar la potència antitumoral de l’adenovirus oncolític ICOVIR15, vam introduir la mutació iLG397T al seu genoma, generant l’ICOVIR-15i. Aquest virus també presenta alliberament viral, citotoxicitat i eficàcia antitumoral incrementades en un model de carcinoma de pulmó humà. En el model de hàmster siri, un model immunocompetent i semipermissiu a la replicació de l’adenovirus, aquest virus presentava eficàcia antitumoral només al combinar-lo amb gemcitabina. Aquesta combinació augmentava la proliferació de limfòcits després de l’estimulació amb cèl•lules tumorals, i a més el seu efecte no s’observà en el model murí immunodeficient amb tumors subcutanis de hàmster siri. Aquests resultats ens permeten suggerir que l’efecte antitumoral de la combinació de l’ICOVIR-15i amb gemcitabina es deu a una resposta immune antitumoral. També vam demostrar que la combinació amb verapamil, un inhibidor dels canals de calci, augmentava l’alliberament viral, la citotoxicitat i l’eficàcia antitumoral en varis models tumorals. Finalment amb l’objectiu d’augmentar l’extravasació del virus cap a la massa tumoral vam introduir el pèptid de penetració tumoral iRGD a la càpsida del l’adenovirus oncolític ICOVIR-15K. Aquest pèptid permet la internalització de les macromolècules a les que està unit a través de la interacció amb integrines i neuropilina-1 sobreexpressades a la vasculatura i a les cèl•lules tumorals, i de la proteòlisi per part una proteasa tumoral. La inserció d’aquest pèptid a la càpsida de l’adenovirus millorà la transducció tumoral sense afectar a la resta d’òrgans, la disseminació intratumoral i l’eficàcia antitumoral del virus. Aquestes diferents estratègies milloren la disseminació intratumoral del virus i l’eficàcia antitumoral i poden ser combinades amb altres estratègies com la degradació de la matriu extracel•lular per millorar encara més l’eficàcia de la teràpia.

Virotherapy with oncolytic adenoviruses holds promise as a new cancer treatment. The main barriers to virotherapy are the poor tumor targeting after systemic administration, the limited intratumoral dissemination hampered by the fibroblasts, and the extracellular matrix present in the tumors and the antiviral immune response. In this thesis we present different strategies to enhance adenovirus intratumoral dissemination based on optimizing adenovirus release and enhancing its extravasation and penetration into the tumor. After multiple rounds of replication in cancer associated fibroblasts (or CAFs) of a mutagenized stock of adenovirus wild type, we isolated an enhanced-release mutant. The mutation responsible for this phenotype, the iLG397T mutation, was identified by sequencing and functional mapping. This mutation enhances adenovirus release and cytotoxicity in CAFs, normal fibroblasts, and a panel of tumor cells. Moreover this mutation increases the antitumor efficacy of the virus in immunodeficient mice with tumors established from tumor cells and mixtures of tumor cells and CAFs. To increase the potency of the oncolytic adenovirus ICOVIR-15, we introduced the iLG397T mutation into its genome, generating the ICOVIR-15i. This virus also displayed enhanced release, cytotoxicity, and antitumor efficacy in a lung carcinoma model. In Syrian hamsters, an immunocompetent semi-permissive model, only the combination of ICOVIR-15i with gemcitabine shows antitumor activity. This antitumor activity led to a lymphocyte proliferation increase after stimulation with tumor cells, and was not observed when the same experiment was performed in immunodeficient mice. These results suggest that the antitumor efficacy of the combination of ICOVIR-15i and gemcitabine is associated to an immune response against tumor antigens. We also described the combination of the virus with verapamil, a calcium channel blocker, to enhance adenovirus release, cytotoxicity and antitumor efficacy. Finally to improve adenovirus extravasation and penetration into the tumor mass, we inserted the iRGD tumor penetrating peptide into ICOVIR15K capsid. The iRGD peptide enhanced internalization into cells by the interaction with integrins and neuropilin-1, after a proteolytic cleavage by a tumor protease. Integrins and neuropilin-1 are overexpressed in the tumor cells and vasculature. The insertion of the iRGD peptide enhanced tumor transduction, intratumoral dissemination of the virus and antitumor efficacy.