Preparació d’oligonucleòtids conformacionalment restringits amb repeticions de trinucleòtids

Abstract

Molt sovint les seqüències de DNA repetitives adopten conformacions diferents a l'habitual estructura de B-DNA. Aquestes conformacions alternatives afecten esdeveniments genètics fonamentals, com poden ser la replicació, la transcripció, la reparació i la recombinació del DNA, induint inestabilitat en el genoma i, en darrer terme, conduint a diferents malalties. En les patologies neurològiques causades per l'expansió de repeticions de triplets, aquestes seqüències repetitives poden adoptar estructures inusuals en el DNA, mentre que els trànscrits de RNA poden, en alguns casos, estructurar-se en forma de llargues forquetes (hairpins) amb bases desaparellades, les quals es troben implicades en la patogènesi dels trastorns.

L'ús d'oligonucleòtids curts com a models per analitzar les conformacions de llargues cadenes de DNA i RNA es veu obstaculitzat per la baixa estabilitat, tant estructural com tèrmica, dels primers en comparació amb els àcids nucleics nadius. En aquest sentit, la incorporació de restriccions conformacionals als models d'oligonucleòtids pot facilitar el seu estudi estructural. El nostre objectiu ha estat el desenvolupament de diferents eines químiques que redueixin la variabilitat conformacional dels oligonucleòtids sintètics amb seqüències repetitives, en particular els formats per les repeticions dels triplets CTG i CUG implicats en la distròfia miotònica.

La primera aproximació que vam dur a terme per tal d’introduir restriccions conformacionals va consistir en la ciclació d’oligonucleòtids en fase sòlida, però va resultar infructuosa. A continuació, vam intentar una estratègia de ciclació assistida per motlle, on les guanosines del precursor lineal van ser parcialment protegides per així evitar la hibridació amb el motlle. Aquesta aproximació va requerir la preparació d'un nou derivat fosforamidit de la guanosina, en el qual la nucleobase es trobava protegida tant en N2 com en O6. Usant aquesta estratègia vam poder preparar amb èxit un 42mer cíclic, el qual contenia catorze repeticions del triplet CUG i on part de les guanines es trobaven parcialment protegides. No obstant això, les condicions per a la desprotecció final de les guanines no van poder ser totalment optimitzades.

Una segona aproximació per tal de reduir la variabilitat conformacional dels àcids nucleics, de la qual es troben descrits nombrosos precedents, és la introducció d'entrecreuaments en els oligonucleòtids. En aquest sentit hem dissenyat i desenvolupat un mètode senzill i eficaç per introduir un entrecreuament entre les cadenes complementàries d'un dúplex. Aquest enllaç covalent no natural no pertorba de forma significativa l'estructura de B-DNA i augmenta de manera important l'estabilitat tèrmica dels dúplexs. A més a més, l'entrecreuament és reversible, podent-se eliminar si així es desitja, sent aquesta reversibilitat una de les propietats desitjades en tals unions.

Quite often, non-B DNA structures are constituted by repetitive DNA sequences. These alternative conformations affect key genetic events such as DNA replication, transcription, recombination and repair, inducing genome instability and eventually leading to human diseases. In the neurological diseases caused by triple repeat expansions, these repeats form unusual non-B DNA structures and, in some cases, long mismatched hairpins of the RNA transcripts are involved in the pathogenesis of the disorders.

Use of short oligonucleotide models to get insight into the conformations of large DNAs and RNAs is hampered by the low structural and thermal stability of the former as compared to the native nucleic acids. Therefore, the incorporation of conformational constraints into the oligonucleotide models may facilitate their structural study. Our aim has been to develop chemical tools that reduce the conformational space accessible to synthetic oligonucleotides, in particular those formed by the CTG and CUG triple repeats involved in myotonic dystrophy. Our first approach to introduce conformational constraints was solid-phase cyclization, but it proved impractical. We then tried a template-assisted cyclization approach, where the guanosines of the linear precursor were partially protected to prevent hybridization with the template. This required preparation of a new guanosine phosphoramidite derivative in which the nucleobase was both N2- and O6-protected. This approach successfully furnished a partially guanine-protected cyclic 42mer containing fourteen CUG repeats. However, conditions for the final guanine deprotection could not be completely optimized.

The second, well-established approach to reduce the conformational mobility of nucleic acids is to form cross-links. We have devised and developed a straightforward method to introduce a cross-link between the complementary chains of a duplex. The nonnatural covalent linkage did not significantly perturb B-DNA structure and dramatically increased the thermal stability of the duplex. Additionally, the cross-link is reversible, which is one of the desired properties of such unions.