Estudio molecular de poblaciones Pseudomonas ambientales

Abstract

El principal objetivo de la Tesis Doctoral es el estudio en profundidad de poblaciones de Pseudomonas presentes en el ambiente. Para ello se ha realizado una prospección de los aislamientos de Pseudomonas procedentes de diversos hábitats. Se han analizado muestras en suelos agrícolas, arenas de la zona intermareal, aguas freáticas y aguas de ríos. Los aislados de Pseudomonas aeruginosa procedentes de muestras ambientales, se han comparado con los aislados clínicos procedentes del Hospital Universitario Son Dureta. Se han aplicado distintas metodologías en el análisis de estos estudios. Métodos dependientes de cultivo, basados en metodología tradicional, y métodos independientes de cultivo basados en nuevos métodos moleculares. Estos últimos incluyen: tipado de secuencias multilocus, secuenciación con cebadores específicos y análisis de DNA total procedente de muestras ambientales por clonación y pirosecuenciación con cebadores específicos. Esta última metodología se ha aplicado por primera vez en muestras ambientales de la manera realizada en esta Tesis. La genómica comparativa se ha aplicado para evaluar la diversidad intraclonal. Se ha estimado el potencial de nuevas metodologías moleculares como la clonación, pirosecuenciación, y estudio de genomas, aplicándolo al análisis de la diversidad de las especies de Pseudomonas. Los datos obtenidos nos permiten tener una amplia perspectiva de estos métodos aplicados a la ecología y taxonomía del género Pseudomonas. En el primer capítulo, se ha analizado la estructura y microdiversidad de 53 aislamientos de muestras ambientales y clínicas de Mallorca (España), mediante el análisis de secuencias multilocus (MLST). Patrones de multiresistencia a distintos antibióticos, solo se hallaron en aislamientos de origen clínico. El elevado número de nuevos alelos y secuencias tipo, halladas en una misma área, refleja la gran diversidad de las poblaciones de P. aeruginosa. A todo ello deben sumarse los índices de diversidad que también indicaron la alta diversidad de la población estudiada. Los tests de clonalidad demostraron que la recombinación juega un papel esencial en la distribución de los alelos. La secuencia tipo ST-1146 fué la única secuencia hallada en los dos tipos de muestras, tres aislamientos en muestras ambientales y un aislado clínico con distinto perfil de resistencia a antibióticos. En el segundo capítulo, los cuatro genomas de los aislados ST-1146 fueron secuenciados y ensamblados de novo. Los resultados indicaron que el número de genes propios del aislado clínico (SD9) era superior al de los aislados de origen ambiental (P37, P47 y P49). Genes relacionados con el bacteriófago Pf1 y otros relacionados con los bacteriófagos F116 y H66 solo se hallaron en SD9 pero no en las otras cepas del ST-1146 de origen ambiental. Los genes relacionados con el bacteriófago Pf1 de SD9 presentaron un elevado número de mutaciones respecto a los aislados de origen ambiental. La comparación genómica demostró que los aislados ST-1146 están estrechamente relacionados y los genes relacionados con la patogenicidad estudiados estaban conservados. El número de alelos exclusivos de SD9 fue 2,5 y 3,6 veces superior a los aislados de origen ambiental, al compararse todos ellos con los genomas de referencia de las cepas P. aeruginosa PAO1-UW y UCBPP-PA14. En el tercer capítulo, el río Woluwe se tomó como hábitat modelo para el estudio de la diversidad de las especies del género Pseudomonas. Una muestra de agua no contaminada se analizó por métodos dependientes e independientes de cultivo. La identificación de los aislados de Pseudomonas se analizó por secuenciación y análisis de los cebadores del gen rpoD. Los métodos independientes de cultivo se basaron en la clonación y pirosecuenciación del amplicón del gen rpoD obtenido con los cebadores selectivos para dicho gen en Pseudomonas: PsEG30F-PsEG790R. Cabe destacar el elevado número de cepas de Pseudomonas obtenidas en las muestras por los tres métodos de análisis: 26 especies distribuidas en 13 grupos o subgrupos filogenéticos. La pirosecuenciación ha sido el mejor método de los utilizados; las secuencias obtenidas correspondieron a 24 de las especies totales observadas, con la excepción de P. stutzeri y P. simiae. El grupo filogenético predominante fue Pseudomonas fluorescens. En todos los métodos de análisis se halló un gran número de posibles nuevas especies indicando una enorme diversidad del género, no descrita hasta el momento. En el cuarto capítulo, se aislaron cepas de Pseudomonas de muestras ambientales procedentes de suelos y zonas intermareales. En el proceso de identificación algunos de estos aislamientos no han podido ser asignados a especies conocidas de Pseudomonas considerándose como posibles nuevas especies. En el análisis de secuencias multilocus se incluyeron cepas procedentes de nuestra colección del laboratorio de Microbiología de la “Universitat de les Illes Baleares”. El análisis de secuencias multilocus demostró que varios aislados podrían corresponder a 3 nuevas especies (6, 5 y 1 aislados de cada especie). La confirmación de estos resultados requerirá posteriores análisis. Otros cuatro aislados fueron estudiados mediante su caracterización morfológica, fisiológica, bioquímica, quimiotaxonómica y genómica. Estos estudios demostraron que los aislados no podían ser asignados a ninguna especie conocida de Pseudomonas por lo que se han propuesto dos cepas nuevas: Pseudomonas aestusnigri (cepa VGXO14T = CECT 8317 T = CCUG 64165 T) y Pseudomonas terricola (cepa S58 T = CECT 8389 T = CCUG 64415 T).

The main goal of the present work is a thorough study of the diversity of Pseudomonas populations present in several habitats. In chapter one, the population structure and microdiversity of 53 Pseudomonas aeruginosa isolates from environmental samples and clinical specimens obtained in Mallorca (Spain) has been analyzed by a multilocus sequence typing approach (MLST). Antibiotic multiresistance to several antibiotics was only found in isolates of clinical origin. The high number of new alleles and new sequence types found in a limited area reflects the great diversity of P. aeruginosa populations and the high plasticity of a paradoxically phylogenetic conserved genome of P. aeruginosa. The calculated genetic diversity index also demonstrated the high diversity of the population under study. Clonality tests demonstrated that recombination plays a key role in the distribution of alleles. The ST-1146 was the only one found in both kind of samples, 3 environmental isolates (from the same site isolated at 2 different dates) and 1 clinical isolate, with differences in its antibiotic susceptibility profile. For this reason, the 4 genomes of newly described sequence type ST-1146 have been sequenced and analyzed. In the second chapter, the four genomes of ST-1146 were obtained and the sequences assembled de novo and compared with the CD-HIT program. Results showed that the number of isolate-specific genes was higher in the clinical isolate (SD9) than in environmental isolates (P37, P47 and P49). Some genes related to phage Pf1 and to other phages similar to bacteriophages F116 and H66 were found in isolate SD9 but not in the other isolates of ST-1146. The bacteriophage Pf1 region in isolate SD9 accumulated the highest number of mutations in comparison with the environmental isolates. Comparative genomic methods indicated that the isolates of ST-1146 are closely related, and most genes implicated in pathogenicity are highly conserved in the environmental isolates, suggesting the genetic potential for infectivity similar to that of the clinical isolate. Moreover, the four genomes were mapped against the reference genomes of P. aeruginosa PAO1-UW and UCBPP-PA14. A mutational profile was performed as a result of each comparison. The clinical isolate showed in both comparisons a number of exclusive alleles 2.5 and 3.6 times greater than the environmental isolates. These results suggest that the mutation pressure is not the same in the environmental isolates than in the clinical one. In the third chapter, the River Woluwe has been taken as a model habitat for the study of the diversity of species in the genus Pseudomonas. A water sample from a non-contaminated site at the source of the river was analyzed by culture-dependent and –independent methods. Identification of the Pseudomonas isolates was performed by sequencing and analysis of their rpoD sequence. Culture-independent methods consisted of a cloning and pyrosequencing of a specific rpoD amplicon obtained from total DNA extracted from the same sample and amplified by Pseudomonas rpoD primer set EGPsF340-EGPsR 780. It was remarkable the number of known species detected in the sample by the three different methods: 26 species distributed in 13 phylogenetic groups or subgroups within the genus. Pyrosequencing was the more powerful analysis; sequences obtained represented the 24 species with the exception of P. stutzeri and P. simiae. The predominant phylogenetic group within the Pseudomonas genus was Pseudomonas fluorescens group in the cultures and in the culture-independent analysis. In all analysis a high number of putative novel species were found indicating the enormous diversity not described yet. In the fourth chapter, several Pseudomonas strains have been isolated from environmental samples, from soil and intertidal habitats. In the identification process, some of these strains have not been assigned to known Pseudomonas species and were considered members of putative novel species. In their phylogenetic characterization by MLSA we found that strains in the culture collection of our laboratory were close-related and therefore they were also included in the taxonomic characterization of these putative novel species. MLSA demonstrated that 3 putative novel species were represented by 6, 5 and 1 strains respectively, which will be the subject of additional studies. Four other strains were deeply studied by a taxonomic polyphasic approach, including morphological, physiological, biochemical, chemotaxonomic and genomic characterizations. These studies demonstrated that the four strains cannot be assigned to any of the known Pseudomonas species and we propose the creation of two novel species, Pseudomonas aestusnigri (strain VGXO14T = CECT 8317 T = CCUG 64165 T) and Pseudomonas terricola (strain S58 T = CECT 8389 T = CCUG 64415 T).