Bioinformatics Approaches to Protein Interaction and Complexes: Application to Pathogen-Host Epitope Mimicry and to Fe-S Cluster Biogenesis Model

Abstract

Les interaccions antigen/anticòs són un dels tipus més interessants d’interaccions proteiques. La millor manera de prevenir les malalties causades per patògens és mitjançant l’ús de vacunes. L’aparició de la genòmica permet fer cerques a tot el genoma de nous candidats vacunals, tècnica anomenada vaccinologia inversa. L’estratègia més comuna on s’aplica la vaccinologia inversa és al disseny de vacunes de subunitats recombinants, que en general generen resposta immune humoral a causa de la presència d’epítops B en les proteïnes del patogen. Un problema important d’aquesta estratègia és la identificació de les proteïnes immunogèniques protectives del surfoma del patogen. El mimetisme epitòpic pot donar lloc a fenòmens autoimmunes relacionats amb diverses malalties humanes. El Capítol I d’aquesta tesi descriu una anàlisi computacional basat en la seqüència on, mitjançant l’aplicació de l’algorisme BLASTP, es van comparar bases de dades d’epítops B lineals coneguts i també de seqüències de proteïnes de superfície dels principals patògens bacterians respiratoris humans amb el proteoma humà. Es va trobar que cap dels 7353 epítops B lineals analitzats tenien regions d’identitat de seqüència amb proteïnes humanes capaces de generar anticossos i alhora que només l'1% de les 2175 proteïnes analitzades contenien alguna zona de seqüència compartida amb el proteoma humà. Aquestes troballes suggereixen l’existència d’un mecanisme per evitar l’autoimmunitat. També proposem una estratègia per corroborar o advertint sobre la viabilitat d’una proteïna que contingui un cert epítop B lineal de ser un bon candidat vacunal mitjançant estudis de vaccinologia inversa. En resum, els epítops sense cap tipus d’identitat de seqüència amb proteïnes humanes han de ser bons candidats vacunals, i al l’inrevés.

El docking proteic és un mètode computacional per predir la millor manera en què interactuen les proteïnes, però, és possible identificar quina és la millor solució d’un programa de docking? La resposta habitual a aquesta pregunta és la solució que tingui més alta puntuació als outputs dels programes de docking, però les interaccions entre proteïnes són processos dinàmics, i moltes vegades la regió d’interacció és prou àmplia com per permetre diferents orientacions i/o energies d'interacció entre elles. En alguns casos, com en un multímer, es poden donar diverses regions d’interacció entre els monòmers. Aquests processos dinàmics impliquen interaccions, amb desplaçaments de superfície entre proteïnes, que porten a assolir la configuració funcional del complex proteic. Així doncs, en molts casos no hi ha una solució estàtica i única per a la interacció entre proteïnes, sinó que es donen diverses configuracions que també haurien de ser analitzades perquè podrien ser importants. Per extreure el conjunt de solucions més representatives dels outputs dels programes de docking, al Capítol II d’aquesta tesi es detalla el desenvolupament d’una aplicació de clústering no supervisada i automàtica, anomenada DockAnalyse. Aquesta aplicació es basa en el mètode ja existent de clústering DBscan, mitjançant el qual es busquen continuïtats entre els clústers generats per la representació de les dades dels outputs de docking. El mètode de clústering DBSCAN és molt robust i resol alguns dels problemes d’inconsistència dels mètodes clàssics de clústering com el tractament dels valors atípics i la dependència alhora de definir prèviament el nombre de clústers. Mitjançant representacions gràfiques i molt visuals, DockAnalyse fa que la interpretació de les solucions de docking sigui més fàcil permetent-nos trobar les més representatives. S’ha utilitzat aquesta nova aplicació per analitzar diverses interaccions proteiques i així poder modelar el comportament dinàmic de la interacció entre les proteïnes d’un complex. DockAnalyse també pot fer-se servir per a descriure regions d’interacció entre proteïnes i, per tant, orientar en futurs assajos de docking flexibles. L’aplicació (feta amb el paquet R) és oberta i accessible. La construcció dels Clústers Ferro-Sofre (ISC) en eucariotes implica interaccions entre diferents proteïnes, entre els quals es troba la proteïna Frataxina. Dèficits d'aquesta proteïna s'han associat amb excés de ferro dins del mitocondri i alteracions en la biogènesi dels ISC ja que es proposa que Frataxina actua com a donadora de ferro per a la construcció d'aquests ISC en aquest orgànul. Una reducció dràstica de Frataxina causa l'Atàxia de Friedreich, una malaltia neurodegenerativa hereditària humana que afecta principalment l'equilibri, la coordinació, els músculs i el cor. Aquest síndrome és l'atàxia autosòmica recessiva més comuna. Entre els mecanismes moleculars d' humans i de llevat que involucren Frataxina s'han trobat moltes similituds així que els llevats representen un bon model per a estudiar aquest procés. En llevat, el complex proteic que forma la plataforma central de muntatge dels passos inicials de la biogènesi dels ISC està composta per la Frataxina homòloga de llevat, el dímer Nfs1-Isd11 i la proteïna Isu. En general, està acceptat que la funció de les proteïnes implica interaccions amb altres proteïnes associades, però en aquest cas no se sap prou sobre l'estructura del complex de proteïnes i, per tant, com funciona exactament. En el Capítol III d'aquesta tesi es proposa un model del complex proteic necessari per a la biogènesi dels ISC amb el que es pretén aprofundir en detalls estructurals que expliquin la funció biològica. Per aconseguir aquest objectiu s'han utilitzat diverses eines de la bioinformàtiques, així com tècniques de modelització i programes de docking de proteïnes. Com a resultat, s'ha modelat l'estructura d'aquest complex proteic i també s'ha suggerit el comportament dinàmic dels seus components, juntament amb la dels àtoms de ferro i sofre necessaris per a la formació dels ISC. Aquestes hipòtesis podrien ajudar a comprendre millor la funció i les propietats moleculars de la proteïna Frataxina, així com els de les seves companyes presents al complex proteic.

Antigen/antibody interactions are one of the most interesting kinds of protein interactions. The best way to prevent diseases caused by pathogens is by the use of vaccines. The advent of genomics enables genome-wide searches of new vaccine candidates, called reverse vaccinology. The most common strategy to apply reverse vaccinology is by designing subunit recombinant vaccines, which usually generate humoral immune response due to B-cell epitopes in proteins. A major problem for this strategy is the identification of protective immunogenic proteins from the surfome of the pathogen. Epitope mimicry may lead to auto-immune condition related to several human diseases. Chapter I of this thesis describes a sequence-based computational analysis that was carried out applying the BLASTP algorithm where databases containing the known linear B-cell epitopes and the surface-protein sequences of the main human respiratory bacterial pathogens were compared to the human proteome. We found that none of the 7353 linear B-cell epitopes analyzed share any sequence identity region with human proteins capable of generating antibodies, and that only 1% of the 2175 exposed proteins analyzed contain a stretch of shared sequence with the human proteome. These findings suggest the existence of a mechanism to avoid autoimmunity. We also propose a strategy for corroborating or warning about the viability of a protein linear B-cell epitope to be a putative vaccine candidate in reverse vaccinology studies. Therefore, epitopes without any sequence identity with human proteins should be good vaccine candidates, and the other way around.

Protein docking is a computational method to predict the best way by which proteins interact, but, is it possible to identify what the best solution of a docking program is? The usual answer to this question is the highest score solution, but interactions between proteins are dynamic processes, and many times the interaction regions are wide enough to permit protein-protein interactions with different orientations and/or interaction energies. In some cases, as in a multimeric protein complex, several interaction regions are possible among the monomers. These dynamic processes involve interactions with surface displacements between the proteins to finally achieve the functional configuration of the protein complex. Consequently, there is not a static and single solution for the interaction between proteins, but there are several important configurations that also have to be analyzed. To extract those representative solutions from the docking output datafile, Chapter II of this thesis details the development of an unsupervised and automatic clustering application, named DockAnalyse. This application is based on the already existing DBscan clustering method, which searches for continuities among the clusters generated by the docking output data representation. The DBscan clustering method is very robust and, moreover, solves some of the inconsistency problems of the classical clustering methods like, for example, the treatment of outliers and the dependence of the previously defined number of clusters. DockAnalyse makes the interpretation of the docking solutions through graphical and visual representations easier by guiding the user to find the representative solutions. We have applied our new approach to analyze several protein interactions and model the dynamic protein interaction behavior of a protein complex. DockAnalyse might also be used to describe interaction regions between proteins and, therefore, guide future flexible dockings. The application (implemented in the R package) is accessible.

The assembly of Iron-Sulfur Clusters (ISCs) in eukaryotes involves interactions between different proteins, among which is important the protein Frataxin. Deficits in this protein have been associated with iron inside the mitochondria and impaired ISC biogenesis as it is postulated to act as the iron donor for ISCs assembly in this organelle. A pronounced lack of Frataxin causes Friedreich's Ataxia, which is a human neurodegenerative and hereditary disease mainly affecting the equilibrium, coordination, muscles and heart. Moreover, it is the most common autosomal recessive ataxia. High similarities between the human and yeast molecular mechanisms that involve Frataxin have been suggested making yeast a good model to study that process. In yeast, the protein complex that forms the central assembly platform for the initial step of ISC biogenesis is composed by yeast Frataxin homolog, Nfs1-Isd11 and Isu. In general, it is commonly accepted that protein function involves interaction with other protein partners, but in this case not enough is known about the structure of the protein complex and, therefore, how it exactly functions. In Chapter III of this thesis a model of the ISC biogenesis protein complex was proposed in order to gain insight into structural details that could end up with its biological function. To achieve this goal several bioinformatics tools, modeling techniques and protein docking programs were used. As a result, the structure of the protein complex and the dynamic behavior of its components, along with that of the iron and sulfur atoms required for the ISC assembly, were modeled. This hypothesis might help to better understand the function and molecular properties of Frataxin as well as those of its ISC assembly protein partners.