Estudis bioquímics i funcionals de les proteïnes implicades en la Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals

Abstract

La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals (MLC) és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant de progressió lenta, que presenta com a principals característiques clíniques macrocefàlia acusada durant els primers anys de vida, deteriorament de les funcions motores, epilèpsia i retard mental de grau mig.

L’any 2001 es va identificar el primer gen responsable de la malaltia en humans denominat MLC1, tot i que existien pacients de MLC que no presentaven mutacions en MLC1 ni lligació amb el seu locus. Això suggeria que hi havia com a mínim un altre gen involucrat en la malaltia. MLC1 codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom que s’expressa en cèl•lules glials. La funció de MLC1 és desconeguda però estudis bioquímics van mostrar que mutacions en aquesta proteïna provoquen una reducció dels nivells de proteïna a la membrana i una forta retenció al reticle endoplasmàtic.

L’objectiu general d’aquesta Tesi és avançar en la comprensió del possible mecanisme d’acció i la funció de la proteïna MLC1 i així aprofundir en el coneixement de la fisiopatologia de la malaltia. Per realitzar aquest objectiu es va seguir l’aproximació experimental d’identificar i analitzar l’interactoma de MLC1.

Per poder validar interaccions entre proteïnes de membrana es va utilitzar el mètode PCA de Split-TEV. Es va observar que el mètode no presentava suficient especificitat i per això, es van realitzar una sèrie de modificacions en la tècnica per obtenir una nova variant de la metodologia amb alta sensibilitat i especificitat.

Paral•lelament, es van realitzar estudis de genòmica i proteòmica que van permetre obtenir un llistat de proteïnes candidates a interaccionar amb MLC1. Es van seleccionar les proteïnes més interessants i es va validar la interacció amb MLC1 per coimmunolocalització en cultius primaris d’astròcits de rata i pel mètode de Split-TEV. Mitjançant col•laboracions del grup es va realitzar un estudi genètic dels candidats favorables a interaccionar amb MLC1 i així es va identificar a GlialCAM com a segon gen implicat en MLC.

GlialCAM és una proteïna amb una estructura similar a les proteïnes d’adhesió que s’expressa en cèl•lules glials. Estudis del grup van descriure a GlialCAM com a subunitat β de MLC1 i subunitat auxiliar del canal de clorur ClC-2, ja que és capaç d’interaccionar i dirigir aquestes proteïnes a les zones de contacte entre cèl•lules i provocar canvis funcional en el canal.

El descobriment de GlialCAM va fer focalitzar els objectius de la Tesi en l’estudi d’aquesta proteïna.

Es van realitzar estudis d’estructura-funció de GlialCAM mitjançant la utilització de proteïnes quimèriques i la generació de delecions. Aquests estudis van identificar el domini extracel•lular de GlialCAM com a domini responsable de la interacció en cis i en trans de la proteïna. El domini citoplasmàtic es va relacionar amb la localització de la proteïna a les unions cel•lulars i finalment, es van identificar els primers aminoàcids del domini transmembrana de GlialCAM com els responsables dels canvis funcionals de ClC-2.

També es van generar i caracteritzar els models knock-down tant de MLC1 com de GlialCAM en cultius primaris d’astròcits de rata. L’estudi d’aquests models i de complementacions dels models amb l’expressió de proteïnes humanes o diferents mutacions de MLC1 i GlialCAM, van permetre descriure GlialCAM com a xaperona necessària per la sortida del reticle endoplasmàtic i la localització de MLC1 a les unions astrocitàries. Estudis funcionals van permetre relacionar MLC1 amb l’activitat VRAC i el control del volum cel•lular i es va identificar com a proteïna responsable de l’aparició de vacuoles astrocitàries en els pacients de MLC. Finalment, es va observar que les mutacions en MLC1 eren capaces d’activar VRAC per se i causaven el defecte en trobar-se retingudes. La coexpressió de GlialCAM amb aquestes mutacions de MLC1 provocava una recuperació de la localització de MLC1 i una disminució del fenotip vacuolitzant astrocitari. Aquest resultat podria ser el principi d’una possible teràpia pels pacients amb MLC basada en l’augment de l’expressió en superfície de les variants mutants de MLC1.

Megalencephalic Leukoencephalopathy with subcortical Cysts (MLC) is a rare type of leukodystrophy characterized by early-onset macrocephaly and delayed-onset neurological deterioration.

In 2001 MLC1 was identified as the first gen involved in 75% of human MLC patients. These results suggested that there was at least another gen involved in MLC pathogenesis. MLC1 is a membrane protein with an unknown function that is expressed in glial cells. Biochemical studies showed a decrease of surface expression and retention in the endoplasmatic reticulum in MLC1 mutations.

The principal aim of this study is to advance in the knowledge of the MLC pathogenesis and the MLC1 function. To accomplish the study, the group performed the identification and analysis of the MLC1 interactome as experimental approach.

The Split-TEV method was used to identify interactions between membrane proteins. However this method showed a low specificity and some modifications were developed to obtain a new variant of Split-TEV method with high sensibility and specificity.

At the same time, using genomic and proteomic studies we identified a list of interaction proteins that were candidates to belong to the MLC1 interactome. The interaction candidates were validated by coimmunolocalization in astrocyte primary cultures and by Split-TEV method. A genetic study was performed with the most favourable candidates and GlialCAM was identified as the second gene involved in MLC disease. GlialCAM is a membrane protein with a similar structure to the adhesion proteins that is expressed in glial cells. Biochemical studies identified GlialCAM as a β subunit of MLC1 and as an auxiliary subunit of the ClC-2 chloride channel.

The aim of this study was focused then to advance in the knowledge of the GlialCAM protein.

We conducted structure-function studies using chimaeric proteins and GlialCAM deletions. These studies identified the extracellular domain of GlialCAM as the responsible domain of the cis and trans protein interaction. The citoplasmatic domain was related to the correct location of the protein in the cell-cell junctions, and the first aminoacids of the transmembrane domain were responsible for the functional changes in ClC-2.

Finally, we developed and characterized MLC1 and GlialCAM knock-down models in astrocyte primary cultures. The study of these models and its complementation with MLC1 and GlialCAM human variants or/and MLC1 and GlialCAM mutant variants, identified a new function of GlialCAM as a chaperone needed for MLC1 endoplasmatic reticulum exit and correct localization in astrocytic junctions. Functional studies implicated MLC1 with the VRAC activation and cell volume regulation. Moreover the coexpression of MLC1 mutant variants with GlialCAM caused an increase of surface expression of MLC1 mutant variants and an activation of VRAC function. These results may be the beginning of a possible pharmacological strategy to obtain a therapy for MLC patients.