Estudios de estructura y función de las interacciones de la trombina con sustratos fisiológicos

Abstract

A pesar de las investigaciones y los importantes avances clínicos, las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. En este sentido, el incompleto conocimiento estructural y funcional de los procesos que en última instancia conducen a la formación del coágulo sanguíneo limita el desarrollo de nuevos antitrombóticos. La proteasa serínica trombina-α cumple un rol clave en el proceso de coagulación sanguínea debido a que activa diversas moléculas que son críticas para la formación del coágulo, entre estas se encuentran el fibrinógeno, el factor XIII, los receptores activados por proteasa en la superficie de las plaquetas (PAR1) y los factores V y VIII. Por estas razones, es imperativo comprender el dinamismo molecular de la trombina y sus interacciones con sustratos fisiológicos. En este sentido, en esta tesis se evaluó el efecto de diferentes ligandos sobre la estabilización de esta proteasa mediante calorimetría, fluorimetría y proteólisis limitada. Nuestros resultados demostraron que los ligandos FPR y el péptido C-terminal de la hirudina actúan sinérgicamente incrementando la termoestabilidad de la trombina. Además, determinamos que la resistencia a proteólisis en el exositio I de la proteasa se ve incrementada en presencia de benzamidina y FPR. Adicionalmente, en este trabajo de tesis doctoral, se analizaron dos de los sustratos más importantes de la trombina, el receptor PAR1 y el factor VIII. En este caso, nuestro objetivo principal fue caracterizar los mecanismos de las interacciones de estas proteínas con su proteasa activadora, la trombina. Para lograr este objetivo el ectodominio del receptor PAR1 y tres fragmentos de FVIII (FVIIIa1 a FVIIIa3; interconectores ácidos que preceden a los sitios de corte de activación) se clonaron, sobreexpresaron, purificaron para realizar ensayos de RMN y de cristalografía de rayos X. En este trabajo se cristalizó y resolvió la estructura 3D del complejo trombina•PAR1(R41S) (refinado a 3.0 Å), lo que nos permitió identificar que los residuos Lys51-Glu57 de PAR1 desempeñan una función esencial en las interacciones con el exositio I de la trombina. Finalmente, mediante ensayos de triple resonancia utilizando el fragmento recombinante FVIIIa1, marcado uniformemente con 13C y 15N, en presencia o ausencia de trombina permitió asignar las resonancias al esqueleto de carbonos α y β del interconector ácido a1. El análisis de las interacciones intermoleculares del FVIIIa1 con su proteasa activadora demostró que un subgrupo de residuos de este interconector son críticos para el reconocimiento del exositio I de la trombina. Estos resultados son un importante paso hacia la comprensión del mecanismo de activación del PAR1 y del FVIII catalizado por trombina.

Decade-long investigations have been result in important clinical advances for cardiovascular diseases; however these pathologies are still the main worldwide cause of morbidity and mortality. To develop novel and better antithrombotics is necessary refine the structural and functional knowledge of the thrombotic process. The serine proteinase alpha-thrombin plays a key role in the blood coagulation process by activating several molecules that are critical for clot formation, most notably fibrinogen, FXIII, protease-activated receptors on the platelet surface (PAR1) and two upstream coagulation factors, FV and FVIII. To understand the molecular dynamisms of thrombin and its interactions with physiological substrates, this thesis work evaluated the effect of ligands on thrombin-stability molecule using calorimetry, fluorimetry and limited proteolysis. Our results demonstrated that the ligands FPR and the C-terminal hirudin peptide, acts synergistically to increase the thermostability of thrombin. Moreover, we showed that the resistance to limited proteolysis of thrombin-exosite I is enhanced by the ligands benzamidine and FPR. On the other hand, the present work characterized the interactions mechanisms between thrombin and two of its most important substrates, PAR1 receptor and factor VIII. To achieve these aims, the ectodomain of PAR1 receptor and three FVIII fragments (FVIIIa1 to FVIIIa3; acidic polypeptides preceding the activation cleavage sites), were cloned, overexpressed, purified, and used for NMR and X-ray crystallization assays. In this thesis work has been crystallized and solved (3.0 Å) the 3D structure of the complex thrombin•PAR1(R41S), which allowed us to identify the residues Lys51-Glu57 of PAR1 as critical in the recognition of thrombin’s exosite I. Furthermore, standard triple-resonance experiments using the uniformly 13C, 15N-labeled recombinant peptide in presence or absence of thrombin showed FVIIIa1 backbone resonances variations corresponding to the intermolecular interactions with the activated thrombin. These variations allowed us to determinate a subset of FVIIIa1 residues that are critical for thrombin recognition. Altogether, our results represent an important advance towards understanding the mechanism of thrombin-catalyzed PAR1 and FVIII activation.