Reaccions adverses a penicil∙lines: Noves eines per la prevenció i el diagnòstic

Abstract

En la present tesi doctoral s’ha plantejat com un dels principals objectius desenvolupar un sistema de diagnòstic in vitro per a detectar al∙lèrgies a fàrmacs β‐lactàmics, i més concretament contra amoxicil∙lina, una de les penicil∙lines més utilitzades com a antibiòtic avui dia. Per tal d’aconseguir els determinants antigènics necessaris per desenvolupar l’assaig desitjat s’han utilitzat dos estratègies.

Una d’elles consisteix en la producció d’antígens a partir de la conjugació de proteïnes a penicil∙lines. Mitjançant aquesta estratègia s’han aconseguit obtenir un total de 17 antígens que es poden classificar en 4 grups diferents, en funció del tipus d’haptè i mètode de conjugació utilitzat.

L’altra estratègia utilitzada és molt més innovadora. Consisteix en la preparació d’una sèrie de sondes peptídiques mitjançant síntesi en fase sòlida. Aquestes sondes, totalment caracteritzades per RMN i MS, han resultat ser reactives a amoxicil∙lina i generar diferents epítops, simulant la unió que pot haver entre una proteïna endògena i el fàrmac abans de desenvolupar una reacció d’hipersensibilitat. Però amb la gran avantatge que aquests adductes han pogut ser aïllats (gràcies a la incorporació d’un grup cromòfor en la sonda peptídica) i caracteritzats per RMN i MS. Concretament, durant aquest treball s’han aconseguit aïllar 3 adductes, dos en medis aquosos isotònics a pH 4,7 i un a pH 11. L’adducte aïllat a pH 11 es correspon amb el que es coneix com el determinant antigènic majoritari de l’amoxicil∙lina, que consisteix en la obertura de l’anell β‐lactàmic per l’atac nucleòfil, d’una amina de les proteïnes. Els dos adductes aïllats a pH 4,7 no s’havien descrit fins el moment i, conseqüentment s’han hagut d’elucidar estructuralment. Per dur a terme aquesta tasca s’han utilitzat tres pèptids simplificats anàlegs a una de les sondes peptídiques emprades. Mitjançant l’elucidació estructural dels compostos formats entre aquests peptíds i l’amoxicil∙lina s’ha aconseguit fer una proposta de les estructures més probables dels adductes creats a pH 4,6. Tant els antígens com els adductes penicil∙línics s’han utilitzat com a determinants antigènics per desenvolupar immunoasssaigs per la detecció de IgEs específiques en sèrums de pacients al∙lèrgics a penicil∙lines. Aquests assaigs s’han desenvolupat en format ELISA i magneto‐ELISA. Gràcies a la preconcentració dels sèrums i la eliminació del senyal inespecífic que ofereix el magneto‐ELISA, s’ha aconseguit desenvolupar un assaig on totes les mostres dels pacients al∙lèrgics han presentat una resposta positiva en front d’algun dels tres adductes. Alguns dels antígens també han sigut reconeguts utilitzant l’assaig ELISA convencional. Per tal d’avaluar a la vegada antígens i adductes es va traslladar l’assaig al format microarray. Però després de fer grans esforços per incrementar el senyal, optimitzant tots els paràmetres possibles de l’assaig no va ser possible detectar IgEs específiques.

El segon bloc d’aquesta tesi consisteix en prevenir les reaccions adverses a penicil∙lines detectant aquests fàrmacs en mostres d’aliments. Per portar a terme aquest segon objectiu es va plantejar desenvolupar un immunoassaig per a la detecció d’amoxicil∙lina en mostres de llet. Per això calia prèviament produir anticossos específics contra amoxicil∙lina. En un primer moment es van desenvolupar anticossos policlonals de conill utilitzant dos tipus d’immunògens que havien estat dissenyats d’una forma racional. L’immunogen Amx1‐PLL estava dissenyat per generar anticossos específics per a reconèixer la part variable de l’amoxicil∙lina mentre que l’immunogen Amx2‐Br‐HCH estava pensat per produir anticossos de família, és a dir, anticossos capaços de reconèixer l’anell β‐lactàmic de totes les penicil∙lines. La polilisina (PLL) va resultar no ser suficientment immunogènica. Pel contrari l’immunogen Amx2‐Br‐HCH sí va produir anticossos contra amoxicil∙lina. Els antisèrums As218 i As219 van presentar una gran afinitat per tots els conjugats amoxicil∙línics produits, però en canvi molt poca competició per la molècula d’amoxicil∙lina. Això va suggerir que una bona part de la població dels anticossos policlonals estaven reconeixent una estructura modificada de la penicil∙lina, concretament la seva forma oberta, l’àcid amoxiciloic. Es va aconseguir obtenir una gran detectabilitat per aquest analit, amb valors de IC50 al voltant de 0.35 μg/L, molt per sota dels límits establerts per aquest fàrmac. Per tant, tot i no haver pogut desenvolupar un assaig contra amoxicil∙lina en forma tancada, sí s’ha aconseguit un assaig amb molt bons resultats per a detectar amoxicil∙lina en forma oberta.

Finalment es va fer un últim intent d’obtenció d’anticossos contra amoxicil∙lina produint anticossos monoclonals. Aquests es produeixen aïllant les cèl∙lules productores d’anticossos o limfòcits B, i clonant aquests amb cèl∙lules tumorals immortals. Els hibridomes resultants s’aïllen individualment, i cadascun d’aquests és capaç de crear una immunoglobulina diferent. Tot i l’esforç emprat en aquesta via, no va ser possible aïllar cap clon productor i per tant no es van poder produir anticossos monoclonals específics contra amoxicil∙lina.

One of the principal aims of this work has been to develope an in vitro diagnostic assay to detect allergies to b‐lactam antibiotics, especially amoxicillin. Two strategies have been applied to obtain all the antigenic determinants.

The first strategy has allowed to obtain 17 different antigenic determinants coming from penicillin G, penicillin V, amoxicillin and ampicillin. This strategy is based on the rational design and synthesis of bioconjugates.

The other strategy uses peptides probes to obtain new antigenic determinants form amoxicillin. The principal advantage of using peptide probes is that adducts can be isolated and characterized in a very easy way. In this case, we have been able to isolate 3 different adducts coming form amoxicillin. Two of them have been obtained at pH 4.6 and one at pH 11. Adduct obtained at pH 11 corresponds with the major determinant. The amine of the lysine reacts with the b‐lactam ring and opens the structure. The two adducts obtained at pH 4.6 have never been described before. The elucidation of its structures has been done synthesizing three new simplify peptide probes. Adducts formed have been successfully analyzed by Mass spectroscopy and NMR.

All these antigens and adducts have been used as antigenic determinants to develop and immunoassay to detect specific IgEs against penicillins. The assay has been tested with serums coming from allergic patients. And the best results have been obtained using the magneto‐ ELISA. All the serums have showed a positive response against almost one of three adducts. The second block of this work has been focus on the adverse reactions prevention detecting penicillin in food samples. The way to achieve this second objective was to develop an immunoassay to detect amoxicillin in milk samples. The antibodies used in this immunoassay were design and produce during this work. Two different immunogen were synthesized but only one was able to produce antibodies against penicillins. Although all the antigens were recognize by the antiserums only showed competition against open‐ring penicillins. Excellent results were achieved detecting amoxicilloic acid. We were able to obtain an assay with a very good detectability (IC50 around 35 μg/L) against amoxicilloic acid.

Monoclonal antibodies were produced during this work too. The aim was to produce specific antibodies against amoxicillin. It wasn’t able produce monoclonal antibodies against this analyte.