Anàlisi de biomarcadors neuropeptídics en fluids biològics per SPE-CE-MS

Abstract

La determinació de biomarcadors peptídics en fluids biològics resulta de gran interès pel diagnòstic, la monitorització i el pronòstic de nombrosos desordres. En aquesta tesi doctoral s’han explorat diverses metodologies d’extracció en fase sòlida acoblada en línia amb l’electroforesi capil•lar amb detecció per espectrometria de masses (SPE-CE-MS) per a l’anàlisi de biomarcadors peptídics, que es troben a baixa concentració en matrius complexes. S’han estudiat principalment pèptids opiacis que estan relacionats amb desordres neurològics i síndromes de dolor crònic.

S’han avaluat diverses fases estacionàries comercials per a l’anàlisi de pèptids opiacis per SPE-CE emprant preconcentradors amb frits i la fase estacionària C18 és la que ha proporcionat millors resultats per a l’anàlisi de mostres de plasma humà. La saturació del preconcentrador s’ha previngut mitjançant un tractament de mostra previ que consta de dues etapes, una precipitació amb acetonitril seguida d’una filtració per centrifugació. Com que l’etapa de filtració és crítica per tal d’obtenir les màximes recuperacions dels anàlits i eliminar la matriu de la mostra, s’han provat filtres de diversos talls moleculars i diverses condicions de filtració. L’acoblament de la SPE-CE a un espectròmetre de masses amb analitzador de temps de vol (TOF-MS) mitjançant una interfase amb líquid auxiliar convencional ha permès disminuir els LOD per a la majoria dels pèptids opiacis en mostres de plasma humà. Per tal de poder detectar concentracions inferiors, s’ha demostrat que la combinació de la SPE-CE amb la tècnica de separació electroforètica isotacoforesi transitòria (tITP) és una bona alternativa.

També, s’ha comparat el comportament de preconcentradors amb i sense frits per a l’anàlisi de pèptids opiacis per C18-SPE-CE-UV i C18-SPE-CE-TOF-MS. S’ha avaluat un prototip recentment desenvolupat d’una interfase nanoelectroesprai (nanoESI) sense líquid auxiliar basada en una punta porosa per a l’anàlisi de pèptids opiacis per CE-MS i també, s’ha establert una metodologia de C18-SPE-CE-TOF-MS emprant un innovador preconcentrador sense frits compatible amb les dimensions específiques del capil•lar de separació requerit per a la interfase nanoESI sense líquid auxiliar.

Una altra possibilitat per a millorar la detecció de pèptids és utilitzar fases estacionàries amb una selectivitat més elevada que el C18, com les fases estacionàries d’immunoafinitat. S’han explorat dos procediments de preparació d’aquest tipus de fases estacionàries: la immobilització d’anticossos intactes oxidats (immunoglobulina G, IgG) a través dels carbohidrats a partícules de sílice activades amb grups hidrazida i la immobilització de fragments d’IgG (fragment d’unió a l’antigen, Fab’) a partícules de sílice activades amb grups succinimidil. Seguint els procediments establerts, s’ha preparat una fase estacionària amb IgG i una altra amb Fab’ contra les endomorfines 1 i 2 (End1 i End2). S’han optimitzat i avaluat metodologies d’IA-SPE-CE-TOF-MS per a l’anàlisi de mescles de patrons d’End1 i d’End2 i s’han analitzat mostres de plasma humà. També, s’ha explorat l’aplicabilitat d’una fase estacionària d’immunoafinitat amb IgG per a l’anàlisi de biomolècules d’elevat pes molecular per IA-SPE-CE-TOF-MS emprant la glicoproteïna transferrina com a model.

The determination of peptide biomarkers in biological fluids has become crucial for the diagnosis, monitoring and prognosis of numerous disorders. This doctoral thesis explores several on-line solid-phase extraction capillary electrophoresis mass spectrometry (SPE-CE-MS) methodologies for the analysis of peptide biomarkers that are found at low concentration in complex matrices, such as opioid peptides.

Several commercial sorbents have been compared for the analysis of opioid peptides by SPE-CE using microcartridges with frits and the C18 sorbent has provided the best results for the analysis of human plasma samples. The saturation of the on-line SPE microcartridge has been prevented by a double-step sample clean-up pretreatment that consists of precipitation with acetonitrile and centrifugal filtration. The coupling of SPE-CE with a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) by a conventional sheathflow interface has provided better LODs. In order to detect lower concentrations, the combination of SPE-CE with the electrophoretic preconcentration technique transient isotachophoresis (tITP) has demonstrated to be a good alternative.

The performances of frit and fritless microcartridges have been compared for the analysis of opioid peptides by C18-SPE-CE-UV and C18-SPE-CE-TOF-MS. A recently developed sheathless nanoelectroespray (nanoESI) interface based on a porous tip has also been evaluated for the analysis of opioid peptides by CE-TOF-MS and a C18-SPE-CE-TOF-MS using a novel fritless microcartridge.

Finally, two different procedures for the preparation of immunoaffinity sorbents (IA) have been explored: the immobilization of intact antibodies (immunoglobulin G, IgG) or IgG fragments (antigen binding fragment, Fab’) to silica particles. Two IA sorbents against Endomorphins 1 and 2 have been prepared following the established procedures. IA-SPE-CE-TOF-MS methodologies have been optimized and evaluated for the analysis of standards solutions of End1 and End2 and human plasma samples. The suitability of an immunoaffinity sorbent with IgG has also been explored for the analysis of large biomolecules by IA-SPE-CE-TOF-MS using the glycoprotein transferrin as a model.