Nuevas funciones de los transportadores concentrativos de nucleósidos CNT1 y CNT2

Abstract

Las proteínas hCNT y hENT tienen un papel importante en la fisiología celular debido a su función como transportadores de nucleósidos naturales. Curiosamente, estas proteínas se expresan en muchos tipos celulares, exhibiendo una aparente redundancia funcional. En el caso de los hCNTs, su expresión es altamente dependiente de diferenciación, siendo baja o indetectable en tejidos indiferenciados o tumores. Asimismo, éstas se encuentran ampliamente reguladas por distintos estímulos que van desde la adenosina, a través de receptores purinérgicos de tipo P1, hormonas y factores de crecimiento, hasta control nutricional, hipoxia o progresión del ciclo celular.

Hallazgos recientes en distintos miembros de la familia SLC han puesto de manifiesto la implicación de algunas de estas proteínas en funciones cruciales de la fisiología celular que van más allá de su papel como meros mediadores de la bioasequibilidad de sus sustratos. Concretamente, hCNT1 tiene un papel como modulador del crecimiento tumoral, y es un transductor de señales independientemente de su capacidad como transportador de nucleósidos. Asimismo, la reciente identificación de proteínas vinculadas al metabolismo celular capaces de interaccionar con hCNT2 y de modular su función anticipa un posible papel de este transportador en la regulación del metabolismo energético. Por eso quisimos validar la interacción de hCNT1 con sus posibles proteínas partner previamente identificadas, en una primera parte de este estudio. Así la inhibición de la migración celular inducida por la restitución de la proteína hCNT1 puede estar mediada por su interacción con otras proteínas. En este sentido, se validó por coinmunoprecipitación la interacción de hCNT1 con RACK1, proteína implicada en procesos de migración. Además, el análisis de expresión a nivel de mRNA de hENT1 y hCNT1, así como también de las posibles proteínas partner RhoGDI2, RACK1 y PSAP en 52 muestras apareadas de CRC (colorrectal carcinoma), mostró una disminución significativa de hENT1, PSAP y RACK1 en tejido tumoral. Por último, en este primer bloque de resultados, observamos que la expresión de la proteína hCNT1 disminuye de manera significativa en tumores de endometrio al compararlo con el tejido no tumoral adyacente, correlacionándose su pérdida con el grado del tumor. En una segunda fase de esta tesis, estudiamos la regulación de rCNT2 por efectores purinérgicos e hipoxia en un modelo neuronal de rata. Vimos que la diferenciación de las células PC12 provocaba la aparición de una actividad dependiente de sodio de tipo CNT2, una disminución de la expresión de los receptores A2A, A2B y A3, y un aumento del receptor A1. Además también observamos que la función CNT2 se regulaba por agonistas que activaban tanto el receptor A1 como el A2A. Estos resultados concuerdan con el hecho de que la adenosina extracelular podría ser responsable de su propia eliminación del medio a través de sus receptores, activando la capacidad de transporte de CNT2. Por otro lado, corroboramos en nuestro modelo, lo que ya se había descrito en tejidos periféricos, que la adenosina extracelular transportada al interior de la célula a través de CNT2, era capaz de activar la AMPK. Por último, obtuvimos que la hipoxia/isquemia puede regular la expresión de rCNT2, lo que apoya nuestra hipótesis inicial de trabajo, en la que CNT2 puede tener un papel como modulador de los niveles de adenosina extracelular. En la última parte de esta tesis estudiamos la posible implicación de hCNT2 en la regulación del metabolismo energético celular en hígado. En este sentido, caracterizamos un panel de líneas hepáticas BCLC, derivadas de hepatocarcinoma humano, y la línea HHL5 establecida de hepatocito humano. Donde observamos que las líneas derivadas de hepatocarcinoma no presentaban transporte de nucleósidos concentrativo de tipo CNT2, dato que concuerda con los estudios realizados en nuestro laboratorio con modelos animales de hepatocarcinogénesis donde se demostraba la pérdida de expresión de CNT2. En cambio la línea derivada de hepatocito humano retenía actividad de tipo CNT2. La restitución de la función hCNT2 mediante vectores adenovirales en las células que perdían la expresión no modificaba el perfil de ciclo celular, al contrario de lo que sucedía con hCNT1 y hENT1. Además, la expresión de los transportadores de nucleósidos se modificaba al inhibir Cdk4/Cdk6 en hígado de ratón, disminuyendo los niveles de mRNA de CNT2 y ENT1, en todos los tejidos analizados. Por último, la restitución de la función hCNT2 en líneas derivadas de hepatocarcinoma, parecería inducir la vía glucolítica y el sistema OXPHOS, observándose un aumento de la expresión de la piruvato quinasa (PK), así como de los metabolitos fructosa-1,6-bis-P y acetil-CoA, acompañado de una menor producción de lactato. El aumento en la capacidad respiratoria y el incremento en la expresión de SCO2, parecerían apuntar a un metabolismo más acoplado al sistema OXPHOS.

hENT and hCNT proteins play an important role in cellular physiology due to its role as natural nucleoside transporters. Interestingly, these proteins are expressed in many cell types, exhibiting an apparent functional redundancy, but hCNTs expression is highly dependent on differentiation. Recent findings in different SLC family members have revealed the involvement of some of these proteins in crucial functions of cell physiology beyond their role as mere mediators of the bioavailability of their substrates. Specifically, hCNT1 has a role as a modulator of tumour growth and hCNT2 function anticipates a possible role of this transporter in energy metabolism due to the recent identification of interacting proteins linked to cell metabolism. Inhibition of cell migration induced by the restitution of hCNT1 protein may be mediated by its interacting proteins. Regarding this, co-immunoprecipitation of RACK1, protein involved in the migration process, with hCNT1 was validated. Furthermore, analysis of mRNA expression levels of hENT1 and hCNT1, as well as, RhoGDI2, PSAP and RACK1, in 52 matched pairs of CRC, showed a significant decrease of hENT1, PSAP and RACK1 in tumour tissue. Also, the protein expression hCNT1 significantly decreases in endometrial tumours when compared to non-tumour tissue adjacent. Secondly, the differentiation of PC12 cells caused the appearance of a CNT2 type sodium-dependent activity, a reduction of the expression of A2A, A2B, and A3, and an increase of A1 receptor. In addition, rCNT2 function was regulated by A1 and A2A agonists. Adenosine uptake mediated by rCNT2, was able to activate AMPK. Finally, we studied the possible involvement of hCNT2 in cellular energy metabolism in liver. We characterized a panel of BCLC lines, derived from human hepatocarcinoma, and the line HHL5, established from human liver. We observed that hepatocellular carcinoma cells did not show any CNT2 type transport activity. In contrast, the HHL5 retained CNT2 activity. Restitution of hCNT2 function did not alter the cell cycle profile, but the inhibition of Cdk4/Cdk6 in mouse liver, provoked a decrease of mRNA CNT2 and ENT1 levels. Finally, restoration of function in cell lines derived from hCNT2 hepatocarcinoma, seemed to induce glycolytic pathway and OXPHOS system