Sistema de lectura eléctrica de microarrays proteomicos

Abstract

En esta tesis se presenta un sistema de lectura eléctrica de microarrays que comprenden una serie de transductores impedimétricos con los cuales realizar la detección multiplexada de hasta 36 eventos biológicos en un mismo sustrato. Al igual que con los microarrays de lectura fluorescente, se han empleado sustratos de vidrio desechables para la fabricación del microarray. Sin embargo, a diferencia de ellos , el sistema presentado es compacto y requiere una instrumentación sencilla y de bajo coste, lo que hace que el sistema pueda ser muy útil para realizar la descentralización de este tipo de medidas analíticas. Otros sistemas de lectura eléctricos compactos reportados anteriormente se basan en la inmovilización de los receptores biológicos específicos sobre la superficie del transductor, lo que hace que sean de un solo uso y por lo tanto costosos. Nuestro sistema combina las ventajas de los sistemas eléctricos anteriores y los escáneres de fluorescencia. El array de electrodos interdigitados (IDEs) se fabricó sobre sustratos de vidrio. Las medidas conductimétricas fueron realizadas con estos transductores mediante la aplicación de reacciones de inmunoensayo que emplean la ureasa como marca. La hidrólisis de la urea catalizada por la ureasa produce especies iónicas en solución que aumentan su conductividad. Los microarrays se fabrican sobre portaobjetos de vidrio convencional. Para la lectura, se coloca sobre el microarray sobre el array de IDEs dejando un espacio de fijo entre ambos, de modo que cada punto del microarray se alinea con su IDE correspondiente. En el proceso de medida se depositaron gotas de solución de medida que contienen urea que ponían en contacto el IDE y el punto correspondiente del microarray. Sin embargo, en un primero trabajo se presentaron algunos inconvenientes importantes relacionados con la evaporación de las gotas y el cross-talk químico entre las gotas adyacentes debido a migración de especies iónicas, lo que hizo que el sistema presentase unas características de sensibilidad y límite de detección sensiblemente más limitadas que las mostradas por los sistemas de detección fluorescente. Por otra parte, se requería de un microdispensador para posicionar con precisión las gotas sobre los transductores. En un segundo trabajo, se encontró una solución para resolver estos inconvenientes y se demostró el potencial del sistema para se un competidor real, en términos de rendimiento analítico, frente a los sistemas basados en fluorescencia. Dicha solución se basó en el empleo una estructura de PDMS que incluye 36 micropocillos de 1.2 µL de volumen, los cuales se disponen sobre el array de transductores para contener el volumen de solución de urea y poder realizar la lectura de cada punto del microarray dentro de una cavidad cerrada. Con esta configuración se consiguió evitar por completo los problemas de evaporación y cross-talk químico. Por último, se presenta un tercer trabajo donde se automatizó este sistema de lectura mediante la implementación de una estructura microfluídica que incluye el array de micropocillos de PDMS así como los componentes fluídicos necesarios para realizar el llenado automático de los mismos así como su lavado posterior una vez realizada la lectura de un microarray. De esta forma, se mejoró el rendimiento del sistema de lectura a la vez que su fiabilidad al minimizar la manipulación por parte de un usuario.

An electrical readout system of microarrays comprising an array of conductimetric transducers, which enabled multiplexed detection of up to 36 biological events on the same substrate, is reported in this thesis. Similarly to fluorescent readout counterparts, regular glass slides were applied for carrying out the microarray. However, unlike them, the presented system is compact and requires a simple and inexpensive instrumentation, thus being ideally suited for deployment of bioarray detection approaches. Other compact electrical readout systems previously reported are based on the immobilization of the specific bioreceptors on the transducer surface, which make them single-use and thus expensive. Our system combines the merits of both previous electrical systems and the fluorescence scanner approaches. An array of 40 μm-pitch gold interdigitated electrode pairs (IDEs) was fabricated on glass substrates. Conductimetric measurements were carried out with these transducers by applying urease-based (urease labeled) immunoassay reactions. The hydrolysis of urea catalyzed by urease produces ionic species in solution that increase its conductivity. In order to carry out such detection scheme, the bioarray was developed on a regular glass slide substrate, which was then placed over the IDE microarray leaving a fixed gap and aligned so that each spot of the bioarray faced one IDE. Therein, the droplets of urea solution were placed in the gap to contact the IDEs and the corresponding spots of the bioarray. However, in the development of the first approach, some major drawbacks related to droplet evaporation and chemical cross-talk between adjacent droplets made the system to be far from achieving the performance of fluorescent detection approaches. Moreover, a microdispenser was required to accurately position the droplets. In a second approach, we found the solution for circumventing these drawbacks and the demonstration of the potential of the system as a real competitor against fluorescence based systems in terms of analytical performance. An array structure of 36 PDMS microwells having a volume of 1.2 μL were fabricated by molding and positioned over the IDE array. The geometry of each microwell includes an O-ring like structure and an empty area around it, which enabled first, to easily fill it without using any specific instrumentation and second, to ensure its liquid tightness once the bioarray was positioned over it. This set-up was demonstrated to completely avoid the evaporation and chemical cross-talk issues. Finally, a third approach is presented, where the readout automatized by means of a microfluidic structure that includes the PDMS microwells together with those fluidic components that enabled the automatic filling with the measuring solution as well as the cleaning step of the system once a microarray was measured. Working in this way improves the throughput of the electrical readout system as well as enhanced its reliability by minimizing the manipulation by the user.