Identificación de mecanismos reguladores de la síntesis de isoprenoides plastídicos mediante la caracterización de mutantes de Arabidopsis thaliana

Abstract

Las plantas, como organismos sésiles, necesitan mecanismos que les permitan adaptarse y poder anticiparse a las condiciones ambientales que pueden influir en sus procesos metabólicos y fisiológicos. Uno de los procesos bioquímicos más relevantes en plantas es la síntesis de isopentenil pirofosfato y dimetilalil pirofosfato mediante la ruta del metileritritol 4-fosfato (MEP) que produce los isoprenoides plastídicos. Buena parte del control de la ruta se da a través de mecanismos postranscripcionales de regulación de los enzimas de la vía, aunque también a través del control de la expresión génica. Entre los mecanismos que regulan la homeóstasis vegetal se encuentra el reloj circadiano, que contribuye a mantener ritmos de aproximadamente 24 horas en diferentes procesos que tienen lugar en la planta. Se seleccionaron mutantes del reloj circadiano de Arabidopsis thaliana con la ruta del MEP alterada a partir de la resistencia a fosmidomicina (FSM), un inhibidor específico del enzima que sintetiza MEP en el primer paso específico de la ruta, 1-Deoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa (DXR). Los mutantes con una pérdida de función del oscilador central del reloj circadiano TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1) presentaron una elevada resistencia a FSM; estos mutantes presentaron niveles elevados de proteína DXR pero no de tránscritos comparado con plantas silvestres, lo que sugiere un tipo de regulación postranscripcional. Mientras que los niveles de proteína DXR permanecen estables en plantas silvestres, la pérdida de función de TOC1 provoca una oscilación de los mismos, observándose la máxima diferencia entre el mutante y las plantas silvestres a principio del día. Esta oscilación de DXR en las plantas mutantes es dependiente de fotoperiodo siendo máxima en día largo. TOC1 podría tener, por otra parte, un efecto represor sobre la división plastídica ya que se observaron plastos más pequeños y en mayor abundancia en el mutante toc1-1. La sobreexpresión de DXR-GFP provoca cambios estructurales en los plastos, entre ellos la formación de vesículas subplastídicas que contienen la proteína recombinante. Dada la importancia de la regulación postranscripcional sobre DXR se planteó como segundo objetivo estudiar la posible participación de chaperonas plastídicas Cpn60 en la regulación de DXR. Experimentos de Complementación Fluorescente Bimolecular demostraron que DXR interacciona in vivo con las dos isoformas de tipo α y las cuatro de tipo β que componen los dos tipos de complejos Cpn60 descritos (α7β7 y β14). Estos resultados sugieren que Cpn60 podría tener un papel en el plegamiento de DXR. El mutante arc2 (deficiente en Cpn60α1) mostró una mayor sensiblidad a FSM y una reducción en los niveles de DXR activa, a pesar del aumento de los niveles de tránscrito con respecto a las plantas silvestres. La sobreexpresión de Cpn60α1-GFP genera también una disminución en los niveles de DXR y en la resistencia a FSM. Es posible que tanto un aumento como una disminución en los niveles de Cpn60α1 desestabilice los complejos Cpn60 α7β7 por alterar la estequiometría de los mismos, además la desestabilización de estos complejos Cpn60 aumenta la tasa de degradación de DXR. Estos datos sugieren que el complejo Cpn60 α7β7 podría replegar y por tanto recuperar formas inactivas de DXR que, de lo contrario, serían degradadas. La pérdida de función de TOC1 no afecta la expresión de ninguno de los genes codificantes para isoformas Cpn60 pero resulta en una disminución en los niveles proteicos de las isoformas Cpn60β. Por tanto, la disminución de subunidades Cpn60β en el mutante toc1-1 podría causar un enriquecimiento de los complejos α7β7 en detrimento de los β14, favoreciendo así el plegamiento y la acumulación de DXR activa.

An important biochemical process in plants is the synthesis of plastidial isoprenoids by the methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway. Posttranscriptional mechanisms that affect enzyme accumulation or activity govern this pathway.

We selected Arabidopsis thaliana mutants by resistance to fosmidomycin (FSM), a specific inhibitor of the enzyme 1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR). Mutants with a loss of function of the circadian clock central oscillator TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1) showed a high resistance to FSM. Interestingly in toc1-1 mutants high DXR protein levels did not affect DXR transcript expression suggesting a posttranscriptional regulation. TOC1 loss of function causes an oscillation of DXR protein levels that remain stable in wild type plants. DXR zenit in mutant plants was reached at the beginning of the day and, being photoperiod dependent, maximized in long day conditions. TOC1 may also affect plastid division since we observed an increased number of smaller plastids in toc1-1 mutants. Indeed DXR-GFP overexpression causes structural changes in plastids including sub-plastidial vesicle formation containing DXR-GFP.

Following the latter results we set as secondary end-point the assessment of a possible involvement of plastidial Cpn60 chaperones in the regulation of DXR. Bimolecular Fluorescence Complementation experiments showed that DXR interacts in vivo with all type of isoforms which are part of Cpn60 complexes. These results suggest that Cpn60 could have a role in the folding of DXR. Mutants deficient in Cpn60α1 showed sensibility to FSM and lower levels of active DXR despite an increase of transcript levels. Unexpectedly the overexpression of Cpn60α1-GFP decreases DXR levels and FSM resistance as well. These findings made us hypothesize that either the increase or the decrease of Cpn60α1 levels destabilizes the Cpn60α7β7 complex by altering its stoichiometry, thus bolstering the DXR degradation rate. Overall these data suggest that the Cpn60α7β7 complex could recover inactive forms of DXR that would otherwise be degraded. On the other hand TOC1 loss-of-function mutation does not affect the expression of genes coding for Cpn60 isoforms but results in a decrease of Cpn60β levels that might enhance the α7β7 complex formation, thus favoring the folding and accumulation of active DXR in toc1-1 mutants.