Aplicació de la detecció electroquímica a l’estudi de fitoquelatines i dels seus complexos metàl·lics en mostres sintètiques i naturals

Abstract

L’objectiu general de la present Tesi Doctoral és la separació i la detecció de molècules d’interès biològic que contenen grups tiols i dels seus complexos metàl•lics en mostres sintètiques i naturals utilitzant la cromatografia de líquids en fase inversa amb detecció electroquímica.

La fitoremediació és una tecnologia basada en l’ús de plantes per eliminar contaminants del medi ambient o reduir-ne la seva toxicitat fins a fer-los innocus. Les fitoquelatines són pèptids rics en cisteïna que sintetitzen les plantes, les algues i alguns fongs i que s’enllacen als metalls pesants mitjançant el grup tiol. Les fitoquelatines estan involucrades en la desintoxicació i l’homeòstasi dels metalls pesants, i és per això que l’estudi de la complexació d’aquestes molècules amb els metalls pesants és d’especial interès.

Per tal d’assolir l’objectiu general, es divideix la Tesi en dos parts ben diferenciades: la primera dirigida al desenvolupament de la metodologia de separació i detecció de les fitoquelatines sintètiques i dels seus complexos amb Hg(II); i la segona dedicada a l’aplicació d’aquesta metodologia a sistemes naturals. Per a aquesta segona part, es seleccionen plantes cultivades en presència de diversos metalls pesants, ja sigui de forma artificial com natural.

Aquesta Tesi es presenta com l’inici d’una nova línia de recerca del grup d’Electroanàlisi dedicada a l’estudi de la complexació de metalls pesants tòxics per les fitoquelatines utilitzant la cromatografia de líquids d’alta resolució (HPLC) en fase inversa acoblada a la detecció electroquímica. Aquesta metodologia es presenta com un mètode selectiu, sensible, senzill i econòmic desenvolupat paral•lelament a les tècniques voltamperomètriques estàtiques, àmpliament utilitzades al grup de recerca, i com una alternativa més econòmica a la detecció per espectrometria de masses globalment utilitzada en estudis de fitoremediació.

La idea principal d’aquesta Tesi Doctoral és la separació i la detecció de fitoquelatines i altres molècules relacionades, així com dels seus complexos amb mercuri. Per tant, la primera part de la memòria (I. Introducció) que consta de tres capítols, està dedicada a la presentació del tema per situar-nos dins de context. A la segona part (II. Metodologia aplicada) s’explica amb detall els fonaments de les tècniques instrumentals i quimiomètriques utilitzades en la present Tesi Doctoral. A la tercera part (III. Experimental) es repassa la instrumentació, els reactius i els procediments de treball utilitzats. Aquesta memòria de Tesi Doctoral es presenta com a compendi de publicacions; els treballs publicats i la discussió dels resultats obtinguts es disposa a la quarta part de la memòria (IV. Resultats i discussió).

Finalment, a la cinquena part de la memòria (V. Conclusions) es presenten les conclusions generals d’aquesta Tesi i a la sisena i última part (VI. Bibliografia) les referències bibliogràfiques consultades.

El objetivo general de esta tesis doctoral es la separación y detección de moléculas de interés biológico que contienen grupos tiol y de sus complejos metálicos en muestras sintéticas y naturales, usando la cromatografía de líquidos en fase reversa con detección electroquímica.

La fitoremediación es una tecnología basada en el uso de plantas para eliminar contaminantes del medio ambiente o reducir su toxicidad hasta hacerlos innocuos. Las fitoquelatinas son péptidos ricos en cisteína que sintetizan las plantas, las algas y algunos hongos y que se enlazan a los metales pesados mediante el grupo tiol. Las fitoquelatinas están involucradas en la desintoxicación y la homeostasis de los metales pesados mediante la quelación de estos iones en el citosol y el almacenaje posterior de estos complejos en las vacuolas. Éste es el motivo por el cual el estudio de la complejación de estas moléculas con los metales pesados es de especial interés.

Para lograr este objetivo general, la tesis se divide en dos partes bien diferenciadas: una primera parte dirigida al desarrollo de la metodología de separación y detección de las fitoquelatinas sintéticas y de sus complejos con Hg(II); y la segunda parte dedicada a la aplicación de esta metodología a sistemas naturales. Para esta segunda parte, se seleccionan plantas cultivadas en presencia de distintos metales pesados, ya sea de forma artificial como natural.

Se han desarrollado diversas metodologías para el análisis de fitoquelatinas y compuestos relacionados, entre las cuales la espectrometría de masas es la técnica más usada. El objetivo de esta tesis es desarrollar una metodología analítica sensible y barata que combine la cromatografía de líquidos de alta resolución con la detección electroquímica utilizando un electrodo de carbono vitrificado. Con esta metodología no sólo se separan i detectan las fitoquelatinas i sus compuestos relacionados sino también sus complejos con el Hg. Entre todos los metales pesados, se escoge el Hg(II) para los estudios de complejación de fitoquelatinas debido a su elevada estabilidad de los complejos formados, aparte de ser un metal altamente toxico con graves efectos perjudiciales para la salud y para el medio ambiente.

En la segunda parte de la tesis, esta metodología se aplica al estudio de plantas cultivadas en presencia de distintos metales pesados. Primeramente se consideran plantas de la especie Hordeum vulgare cultivadas en presencia de Hg(II) y en presencia simultánea de Hg(II) y Cd(II), y se evalúa la síntesis de fitoquelatinas provocada por estos metales tóxicos. De forma similar se evalúa la capacidad inductora de fitoquelatinas de distintos metales pesados, como son el Hg(II), el Cd(II), el Pb(II) y el As(III) y se compara la capacidad para inducir fitoquelatinas de cada uno de ellos. Finalmente se estudian plantas contaminadas con Hg de forma natural, procedentes de la zona de Almadén. Esta zona es mundialmente conocida por las minas de Hg más grandes que se han descubierta hasta la actualidad. Por este motivo, este estudio es de especial interés ya que permite profundizar en los mecanismos naturales que han desarrollado las plantas para combatir la toxicidad del mercurio.

Debido a que esta tesis opta a la Mención Internacional de Doctorado, en un último capítulo se presentan los resultados obtenidos en la estancia pre-doctoral realizada a la Facultad de Farmacia de la Université Libre de Bruxelles (Bélgica) bajo la supervisión del Professor Jean-Michel Kauffmann. La temática de la estancia efectuada en este centro europeo se enmarca perfectamente dentro del proyecto de tesis, ya que amplía los sistemas de detección de compuestos tiólicos con la utilización de electrodos de plata.