Force sensors based on piezoresistive and MOSFET cantilevers for biomolecular sensing

Abstract

Los procesos de reconocimiento biomolecular entre receptores y ligandos son muy importantes en biología. Estas biomoléculas pueden desarrollar complejos muy específicos y tener una variedad de funciones como replicación y transcripción genómica, actividad enzimática, respuesta inmune, señalamiento celular, etc. La complementariedad inequívoca mostrada por estos componentes biológicos es ampliamente utilizada para desarrollar biosensores. Dependiendo de la naturaleza de las señales que se convierten, los biosensores pueden ser clasificados en ópticos, eléctricos o mecánicos. Entre los sensores mecánicos, los microcantilevers son los más comunes. Han sido utilizados como sensores de estrés superficial o como sensores de masa en detección de biomoléculas, desde hace más de 10 años. El enlace de las moléculas a sus superficies funcionalizadas se puede detectar midiendo la deflexión en modo estático o la variación de la frecuencia de resonancia en modo dinámico. Para lograr la máxima resolución, la deflexión es medida por un láser y un fotodetector. Este método limita las medidas en fluidos transparentes, la portabilidad del instrumento, e incrementa la complejidad de medición multiplexada. El desarrollo de cantilevers sensibles a la deflexión mediante la integración de piezoresistores o transistores de efecto de campo (MOSFET) implementados en el mismo voladizo, resuelve este problema. Sin embargo, simultáneamente se disminuye la resolución del sensor debido al incremento del ruido electrónico. Por otro lado, se puede detectar moléculas midiendo la fuerza de enlace entre una molécula y su receptor, estirando el complejo molecular, mediante espectroscopia de fuerza atómica (AFS), técnica basada en el microscopio de fuerza atómica (AFM). A pesar de la elevada resolución en fuerza, el AFM no ha logrado aún convertirse en instrumento analítico debido principalmente a la complejidad del mismo y de su uso. Un biosensor basado en cantilevers que puedan detectar su propia deflexión y que emplee la AFS, tendría resolución de una molécula, podría ser utilizado en fluidos opacos, tendría potencial de multiplexado y su integración a una celda microfluídica sería viable. Considerando esto, se desarrollaron cantilevers dotados de resolución de pN y compatibles con líquidos. Se diseñaron y modelaron cantilevers basados en silicio cristalino y se ha optimizado el proceso de fabricación para aumentar la sensibilidad y el rendimiento. Asímismo, se ha trabajado sobre el modelo, el desarrollo y la fabricación de cantilevers con un MOSFET integrado. Se concluye que el primer sensor ofrece una solución tecnológica más directa, aunque el segundo puede ser una buena alternativa. Simultáneo a la fabricación de sensores, se desarrollaron también nuevas técnicas y montajes para la rápida caracterización eléctrica y electromecánica de los sensores de manera precisa y fiable. Esto fue crucial a la hora de validar el proceso de producción y los dispositivos finales. Después de obtener muy alta resolución (<10 pN en líquido) con elevado rendimiento en la producción, los sensores fueron utilizados para el estudio de procesos de reconocimiento molecular entre avidina y biotina. Para lograr este objetivo, los sensores fueron integrados en un AFM comercial para aprovechar su elevada estabilidad mecánica y el desplazamiento nanométrico del piezoactuador. Se detectaron con éxito las fuerzas de enlace relacionadas a la formación del complejo molecular biotina-avidina, resaltando de esta manera, la posibilidad de detección label-free de biomoléculas en condiciones cuasi fisiológicas con resolución de una molécula. Además de la elevada sensibilidad, estos sensores pueden utilizarse sin restricciones en fluidos opacos, se pueden integrar fácilmente en celdas microfluídicas y demuestran capacidad para el multiplexado. Este resultado abre nuevas perspectivas en detectores de marcadores biológicos con elevada sensibilidad y que puedan trabajar en condiciones fisiológicas.

Biorecognition processes between receptors and their conjugate ligands are very important in biology. These biomolecules can build up very specific complexes displaying a variety of functions such as genome replication and transcription, enzymatic activity, immune response, cellular signaling, etc. The unambiguous one-to-one complementarity exhibited by these biological partners is widely exploited also in biotechnology to develop biosensors. Depending on the nature of the transduction signals, biosensors can be classified in optical, electrical and mechanical. Among mechanical biosensors, the microcantilevers play a prominent role. They have been used as stress or mass transducers in biomolecules detection for already more than a decade. The binding of molecules to their functionalized surface is detected by measuring either the deflection in static mode or the resonant frequency shift in dynamic mode. The deflection of the cantilever is converted optically by a laser and a photodetector in order to have the highest possible resolution. This limits the measurements in transparent liquids, the portability of the instrument and increases the complexity for multiplexing. The development of self-sensing cantilevers by integrating piezoresistors or metal-oxide-semiconductor field effect transistors (MOSFET) into the cantilever solves this issue. However, at the same time, this decreases the bending and frequency shift resolution due to the higher transducer noise. On the other hand, the detection of a single molecule can be attained measuring the unbinding force between two molecules of a complex pulling them apart, using the atomic force spectroscopy (AFS) measuring approach. This technique is based on the atomic force microscope (AFM). Despite the high force resolution, AFM has still not become an analytical instrument and it is mainly due to the complexity of the instrument and of its use. A biosensor based on AFS and on self-sensing cantilever would allow single molecule resolution, working in opaque fluids, easy multiplexing capability, and relatively easy integration in microfluidics cells. In this perspective, we worked to obtain self sensing-probes endowed with pN resolution and compatible with liquid media. Cantilevers based on single crystalline silicon have been modeled and the fabrication process has been optimized to improve the force sensitivity and to obtain high fabrication yield. At the same time we worked also on the modeling, development and fabrication of cantilevers with embedded MOSFET piezoresistive transducers. It turned out that the probes with integrated piezoresistor offer a more straightforward solution, but also the MOSFET cantilever can offer a good alternative. Alongside the force sensors fabrication, new high-throughput set-ups and techniques have been developed and optimized to measure the electrical and electromechanical characteristics of micro-electro-mechanical systems (MEMS) in a precise and reliable way. This was of key importance to correctly validate the new technological processes involved in production as well as characterize the final devices. After achieving very good sensor performances (resolution < 10 pN in liquid environment) with high production yield, we used the force probes to investigate the biorecognition processes in the avidin-biotin complex. For this purpose we integrated the sensor into a commercial AFM to take advantage of the high mechanical stability of this equipment and the highly reliable displacement of the piezo actuator. We detected the forces related to the avidin-biotin complex formation, highlighting the possibility of biomolecule label-free recognition in nearly physiological conditions and at single molecule resolution. Beside the very high sensitivity attained, the sensor can be used with no restrictions in opaque media; it can be easily integrated in microfluidic cells and it displays a high multiplexing potentiality. This result opens new perspectives in highly sensitive label free biomarkers detectors in nearly physiological conditions.