Implicaciones del Purinoma en la Biología y Patología del Epitelio Biliar

Abstract

El purinoma está formado por la red de proteínas de membrana que median el efecto biológico final de la adenosina (Ado) extracelular y sus metabolitos (ATP, ADP y AMP). Sus componentes actúan de forma sinérgica y concertada para iniciar, mantener y terminar la señal purinérgica. Los elementos que conforman esta red son: los receptores purinérgicos P1 de adenosina, los receptores purinérgicos P2 para ATP y ADP, las ATP/ADPasas (nucleotidasas) responsables de la degradación extracelular del ATP y ADP, y los transportadores de nucleósidos equilibrativos (ENTs) y concentrativos (CNTs) encargados del reciclaje de la adenosina.

Los colangiocitos son células epiteliales que conforman el tracto biliar intra y extrahepático y se distribuyen en una red tridimensional de ductos interconectados. Su principal función es la de sensar y modificar la composición de la bilis proveniente de los cálculos biliares. Pero también participan junto a los hepatocitos en la detoxificación de xenobióticos. A un cuando los principales mecanismos efectores de estas funciones están directamente relacionados con el ATP extracelular y activación de los receptores P2, nada ha sido descrito para el resto de los componentes del purinoma.

En los últimos años, el interés en el estudio de la fisiología de los colangiocitos ha aumentado significativamente debido al incremento progresivo en la incidencia de las enfermedades hepáticas colestásicas y del cáncer de tracto biliar a nivel mundial. El colangiocarcinoma (CC) proveniente de la transformación neoplásica de los colangiocitos, es el principal cáncer de conducto biliar. Debido a que es un cáncer de detección tardía, la principal opción para el tratamiento es la quimioterapia.

Entre los agentes quimioterapéuticos más estudiados para su uso en monoterapia se encuentran derivados de uracilo como el 5‐Fluoruracilo (5‐FU), o derivados de nucleósidos como la citidina (gemcitabina), o de la uridina (capecitabina); también se utilizan agentes como el Cisplatino. Estos fármacos se utilizan también en combinaciones para aumentar la efectividad de la terapia. A pesar de que en otros modelos epiteliales humanos se ha demostrado que el transporte de los quimioterápicos, análogos de nucleósidos, al interior celular se hace por medio de NT, en la actualidad no existe ninguna evidencia ni de los mecanismos de entrada, ni de las entidades que median estos procesos en CC o en modelos no tumorales de colangiocitos.

Los resultados principales de esta tesis muestran la presencia funcional de nuevos elementos del purinoma tanto en colangiocitos de rata, como en líneas celulares humanas de CC. En el modelo fisiológico de colangiocitos, describimos un crosstalk específico entre los transportadores de adenosina (CNT3 y CNT2), el receptor de alta afinidad para adenosina (A2A) y el receptor de ATP (P2Y2). Estos resultados indican que los receptores A2A y P2Y2, a través de un mecanismo dependiente de la vía intracelular dependiente de cAMP/PKA/ERK/CREB, están controlando la actividad de CNT3 y CNT2 y por lo tanto la recaptación de adenosina. Adicionalmente, confirmamos por primera vez que la entrada de la adenosina es diferencialmente modulada por los principales estímulos secretores del colangiocito (secretina y ATP).

En el segundo capítulo, describimos los resultados del estudio extensivo de la expresión y actividad de los transportadores de nucleósidos en 8 biopsias humanas con diagnóstico confirmado de CC y en 8 líneas celulares humanas de CC, para la evaluación de cambios en la expresión luego de la exposición a diferentes régimenes de tratamientos con fármacos utilizados en la terapia del CC. Para complementar estos resultados también analizamos la expresión basal de 40 genes involucrados en la captación, metabolización y salida de estos fármacos. Los principales resultados revelaron que la expresión de MRP3 y OATP3 podrían correlacionar con la respuesta a la quimioterapia del CC.

The purinoma is the molecular network that mediates the final effects of the extracellular adenosine and its metabolites. The components of this network are: P1 receptors for adenosine, P2 receptors for ATP/ADP, the ATP/ADPasas responsible for extracellular degradation of ATP, and the equilibrative (ENTs) and concentrative (CNTs) nucleoside tranporters responsible for the recycling of adenosine.

Cholangiocytes are epithelial cells that form the intra and extrahepatic biliary tract. In recent years, interest in the study of the physiology of cholangiocytes has increased signicantly due to the progressive increment in the incidence of cholestatic liver diseases and cholangiocarcinoma (CC) worldwide. The nucleoside‐derivatives drugs; 5‐Fluorouracil and gemcitabine, are the principal therapy indicated for the treatment of CC. Although in other human epithelial models have been shown that transport of nucleosideanalogues drugs into the cell is done by means of the nucleoside transporters, at the moment there is no evidence of the uptake mechanisms, nor the proteins that mediate these processes in CC or in non‐tumor models of the biliary epithelia.

The principal results in this thesis showed the presence of new elements of the purinome in both rat cholangiocytes and in human CC cell lines. In the physiologic model of cholangiocytes we found a specific crosstalk between the adenosine transporters (CNT3 and CNT2), the adenosine A2A receptor and the P2Y2 receptor. Our key findings indicated that A2A and P2Y2 receptors, which trough a mechanism dependent of the cAMP/PKA/ERK/CREB axis, are controlling the activity of CNT3 and CNT2 and thus the cellular uptake of adenosine. Additionally, for the first time we confirmed that adenosine transport is differentially modulated by the main secretory stimuli described in cholangiocytes (secretin and ATP).

We also performed an extensive study of the expression and activity of the nucleoside transporters in 8 cell lines and in 8 human biopsies of CC, evaluating changes after the exposure to different cancer drugs. We also analyzed the basal expression of 40 genes involved in the uptake, metabolism and extrusion of these drugs. The principal results of this approach revealed that the expression of MRP3 and OATP3 would possibly correlate with the response to the chemotherapy in CC.