Antibiotic resistance genes in the viral DNA fraction of environmental samples = Gens de resistència a antibiòtics en el DNA de la fracció vírica de mostres ambientals

Abstract

The PhD thesis presented here has as a main objective the study of antibiotic resistance genes clinically relevant in the DNA fraction of bacteriophage particles isolated from environmental samples of different origin in order to determine the importance of bacteriophages as vehicles for the mobilization of antibiotic resistance genes between bacteria. Specifically, a broad range of antibiotic resistance genes were studied as representative of the main groups recently described in our geographical area belonging to three β-lactamases (blaTEM, blaCTXM-1 and blaCTX-M-9), the mecA gene conferring resistance to methicillin in staphylococci, and the quinolones resistance genes qnrA and qnrS. To achieve these goals samples of urban wastewater, river water and animal faecal wastes were analysed quantifying the antibiotic resistance genes of interest in bacteriophages DNA. During the development of this Thesis, it was attempted to optimize the available methodology for bacteriophage DNA extraction, as well as the necessary controls to guarantee the amplification of encapsidated DNA and to remove any free DNA in the samples and any possible vesicles containing DNA. In addition, the ability of phage-encoded genes to confer antibiotic resistance in bacterial strains was assessed by performing transformation experiments. It was also studied the influence of various compounds involved in the induction of the lytic cycle of temperate bacteriophages, on the abundance of antibiotic resistance genes in DNA from the phage fraction in wastewater samples. Finally, due to the importance of horizontal gene transfer as a mechanism for antibiotic resistance dissemination in clinical and environmental settings, transduction experiments were attempted to reproduce in vitro the process that would take place in nature. The research developed in this Thesis is divided into 5 studies included in 4 chapters: (1) Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of water samples (wastewater, river water and animal wastewater); (2) Quinolone resistance genes (qnrA and qnrS) in bacteriophage particles from wastewater samples and the effect of inducing agents on packaged antibiotic resistance genes; (3) Evaluation of ARGs in the DNA of bacterial and bacteriophage fraction in wastewater samples from Tunisia and comparison with results obtained in Barcelona area; (4) Detection of quinolone-resistant Escherichia coli isolates belonging to clonal groups O25b:H4-B2-ST131 and O25b:H4-D-ST69 in water samples from Barcelona area. Each of the studies has given rise to a scientific article already published or submitted for scientific publication.

La tesi doctoral que es presenta a continuació té com a objectiu principal l’estudi de gens de resistència a antibiòtics de rellevància clínica en la fracció de DNA de partícules de bacteriòfags aïllades de diferents tipus de mostres ambientals per tal de determinar la importància dels bacteriòfags com a vehicles de mobilització de gens de resistència a antibiòtics entre bacteris. S’ha estudiat un ampli espectre de gens de resistència a antibiòtics com a representants dels grups principals descrits actualment en la nostra àrea geogràfica corresponent a tres β-lactamases (blaTEM, blaCTXM-1 i blaCTX-M-9), el gen mecA de resistència a meticil•lina en estafilococs, i els gens de resistència a quinolones qnrA i qnrS. Per això s’han analitzat diversos tipus de mostres procedents d’aigua residual municipal, d’aigua de riu i d’aigua residual amb contaminació fecal animal per tal de quantificar els gens de resistència a antibiòtics d’interès en DNA aïllat de bacteriòfags. Durant els diferents estudis s’ha intentat optimitzar la metodologia d’extracció de DNA de bacteriòfags així com els controls corresponents per garantir l’amplificació de DNA encapsidat i l’eliminació de qualsevol DNA lliure present a les mostres i de qualsevol possible vesícula amb DNA al seu interior. Per altra banda, també s’ha determinat la capacitat funcional dels gens de resistència detectats en DNA de fags i per això s’han realitzat experiments de transformació a partir de soques bacterianes sensibles a un determinat antibiòtic amb l’objectiu d’incorporar la resistència i per tant, esdevenir resistents a l’antibiòtic en qüestió. També, s’ha estudiat la influència de determinats compostos implicats en la inducció del cicle lític de bacteriòfags temperats, en l’augment en el nombre de còpies de gens de resistència a antibiòtics en DNA present en la fracció de fags de l’aigua residual. Finalment, degut a la importància de la transferència horitzontal de gens com a mecanisme de dispersió de la resistència a antibiòtics en el medi ambient i en clínica s’han dut a terme experiments de transducció per tal d’intentar reproduir in vitro el procés que tindria lloc de manera natural.