Paper de la proteïna ZAP-70 en la regulació de la interacció de la leucèmia limfàtica crònica amb el microambient

Abstract

La Leucèmia Limfàtica Crònica (LLC) és una neoplàsia maligna caracteritzada per l’acumulació monoclonal i progressiva de limfòcits B madurs a la sang, moll de l’os i òrgans limfoides. És la leucèmia més comú al món occidental, afecta als adults i la seva incidència és major en edats avançades, essent més freqüent en homes. Malgrat els avenços en el coneixement de la patogenicitat, la LLC continua essent una malaltia incurable. La LLC és una malaltia clínicament molt heterogènia. Els pacients poden presentar una evolució molt ràpida de la malaltia o, per contra, tenir una esperança de vida normal.

Un dels factors pronòstic independents que ajuda a determinar la probabilitat de progressió i la supervivència és la proteïna ZAP-70. Aquesta proteïna ha estat associada amb una major senyalització del BCR i a una major resposta a estímuls de supervivència i migració. Aquests estímuls provindrien d’ambients favorables com el present als ganglis limfàtics i al moll de l’os, localització preferent de les cèl•lules de LLC. Amb aquest coneixement, la present tesi va ésser plantejada amb l’objectiu d’estudiar els efectes de la proteïna ZAP-70 en la regulació de la interacció de les cèl•lules de LLC amb el microambient.

El primer estudi es va iniciar amb la generació de dues línies cel•lulars que expressen la proteïna ZAP-70 de manera estable. La proteïna ZAP-70 va augmentar la senyalització de l’IgM-BCR, i no de l’IgD-BCR, mitjançant l'activació d’Akt i ERK1/2. L’activació constitutiva de ZAP-70, a la segona línia estable, va permetre observar que, per si sola, ZAP-70 és capaç de potenciar l’activació de la via de les MAPK. També es va observar que ZAP-70 pot retardar la internalització d’elements del BCR posterior a l’activació d’aquest, explicant la perllongada activitat senyalitzadora. L’estimulació del BCR en cèl•lules amb expressió de ZAP-70 va ésser capaç de modular diferencialment l'expressió de diferents receptors de quimioquines, destacant l’augment d’expressió de CCR7, el qual va resultar ésser depenent de l’activació d’ERK1/2. Nivells elevats d’aquest receptor van implicar major senyalització d’aquest, posterior a la lligació de la quimioquina CCL21, i major migració in vitro. Estudis amb mostres primàries de pacients amb LLC varen mostrar elevada expressió de CCR7 en cèl•lules amb alta expressió de ZAP-70, així com elevada capacitat de migració.

El segon estudi es va plantejar amb l’objectiu d’observar, in vivo, la capacitat d'infiltració dels limfòcits B malignes amb expressió de ZAP-70 com a únic factor diferencial. Els ratolins inoculats amb limfòcits amb expressió de ZAP-70 no varen presentar diferències en supervivència respecte als ratolins controls però sí es va observar una major infiltració del moll de l’os. La principal quimioquina que regula el tràfic de limfòcits al moll de l’os és la CXCL12 i els nostres estudis varen confirmar in vitro que ZAP-70 provoca una major migració cel•lular a aquesta quimioquina. Aquest augment de migració no es dóna per un increment en els nivells del receptor CXCR4, sinó per una major senyalització d’aquest amb la lligació de la quimioquina.

En conclusió, segons les nostres observacions, la proteïna ZAP-70 augmenta la senyalització del BCR i modula l'expressió d'alguns receptors de quimioquines com el CCR7. ZAP-70 augmenta la infiltració del moll de l’os per la cèl•lula B maligna, principalment per una major senyalització del receptor CXCR4 posteriorment a la seva estimulació. En pacients amb LLC, aquest mecanisme facilitaria l’accés de les cèl•lules malignes a rebre estímuls anti-apoptòtics i senyals de proliferació en un ambient favorable, com és el moll de l’os. En conseqüència, possibles teràpies inhibidores d’aquest tàndem CXCR4/CXCL12 podrien contribuir a la millora en el tractament d’aquesta malaltia.

Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a malignant neoplasm characterized by the monoclonal and progressive accumulation of mature B lymphocytes in blood, bone marrow and lymph nodes. CLL is the most common leukemia found in adults in Western countries being slightly more common in men. Despite significant advances in understanding the pathogenesis, it is still an incurable disease. CLL is a very heterogeneous disease and patients can have a very fast progression or conversely, have a normal life span.

One of the independent prognostic factors that help to determine the progression and survival is ZAP-70 protein. This protein has been related to enhanced signaling through the BCR, and to increased response to diverse migrative and survival stimuli. These stimuli come from favorables microenvironments, mainly from the lymph node and bone marrow, where these cells accumulate. Against this background, this thesis aimed to ascertain the specific influence of ZAP-70 protein in the crosstalk between CLL cells and the microenvironment.

The first study was initiated with the generation of two cell lines stably expressing ZAP-70 protein. The protein ZAP-70 increased the signaling from IgM-BCR, but not from IgD-BCR, by enhancing Akt and ERK1/2 activation. Constitutively active ZAP-70 found in the second cell line was sufficient to potentiate MAPK signaling. A delayed internalization of components from the BCR was observed after receptor activation in ZAP-70 expressing cells, probably explaining the increased activation observed. Stimulation of the BCR in ZAP-70-expressing cell line lead to a differential modulation of chemokine receptors expression. The most significant change was the up-regulation of CCR7 expression, which was depenent on the activation of ERK1/2. Moreover, stimulation of CCR7 with CCL21 in ZAP-70-expressing cells caused an increased signaling and migration in vitro. Subsequent analysis of primary samples from patients with CLL confirmed the increased expression of CCR7 and migrative capacity in ZAP-70 positive cells.

The aim of the second study was to observe in vivo the migratory pattern of cells with ZAP-70 expression as the only variable. Mice inoculated with a ZAP-70 expressing cell line did not have a different survival from that of control mice, however, a remarkable greater infiltration of the bone marrow was observed in these mice. The main chemokine regulating the trafficking of B-lymphocytes into the bone marrow is CXCL12. In vitro experiments showed that ZAP-70 causes an increased migration toward this chemokine. This enhanced migration was not related to an increased expression of the CXCR4 receptor but to an enhanced signaling upon chemokine ligation.

Collectively, our findings suggest that ZAP-70 enhances BCR signaling and modulates chemokie receptors on cell surface such as CCR7. ZAP-70 enhances the migration of malignant B-cells into the bone marrow mainly by enhancing signaling and migration after CXCR4 stimulation. In patients with CLL, this mechanism would facilitate the access of malignant cells to receive additional survival, anti-apoptotic and proliferative signals that can be found in the supportive microenvironment of the bone marrow. Consequently, the development of new treatments blocking the tandem CXCR4/CXCL12 may contribute to the improvement of the CLL treatment strategy.