Biofuncionalización de superficies de titanio con colágeno tipo I para mejorar el sellado biológico de implantes dentales

Abstract

To obtain a regeneration and integration of gingival tissues onto the dental implant surface, is essential to achieve an appropriate cellular response. To promote an appropriate cellular response, materials surface has been frequently coated with a number of proteins, peptides and other biomolecules with similar properties to those of extracellular matrix proteins, which provides cell binding sites. Thus, the strategy proposed in this work to promote the integration of the gingival tissue over the implant is the biofunctionalization of titanium surface with type I collagen, which has GFOGER amino acid sequences that promote fibroblast response and thereby significantly reducing recovery time of the tissues post-implantation is expected. The studies performed in this work analyzed in depth the influence of both the method of metal surface activation (plasma or acid attack), such as collagen-binding method (physisorption or covalent bond by silanes), on the amount, stability and conformation of collagen layer immobilized on titanium, and ultimately the influence of collagen on fibroblast adhesion, proliferation, and activation, as well as the influence on the beginning of secretion and reorganization of extracellular matrix.

El éxito clínico de los implantes dentales depende de una satisfactoria integración de la superficie del material con los tejidos que lo rodean. Dicha integración depende de dos tipos de interacciones interfaciales: una es la interacción con el tejido del hueso, denominada como osteointegración y la otra es la interacción con los tejidos blandos de la encía sobre el cuello del implante, denominado sellado biológico. Un buen sellado biológico evita el paso de bacterias y gérmenes a través de la interfaz implante-tejido, y previene por tanto el posterior aflojamiento y perdida del implante. La mejora del sellado biológico a corto y largo plazo, dependerá de las propiedades físico-químicas de la superficie del material y de su capacidad para promover y/o acelerar los procesos de curación y restauración de los tejidos de la encía después de la implantación. En este trabajo se propuso la biofuncionalización de superficies de titanio con colágeno tipo I, como estrategia para mejorar el sellado biológico de implantes dentales. El colágeno tipo I es el principal componente de la matriz extracelular de los tejidos de la encía, y ha sido reportado como un excelente promotor de la adhesión de diferentes tipos de células gingivales. En este estudio se analizó la posibilidad de utilizar silanos como agentes de acoplamiento para formar un enlace covalente entre el metal y la molécula orgánica, y obtener una mayor estabilidad a largo plazo en comparación con la fisisorción. Se llevó a cabo un estudio de las distintas etapas del proceso de inmovilización de colágeno sobre la superficie de titanio: i) limpieza y activación de la superficie, mediante procedimientos físicos (plasma de oxígeno) o químicos (ataque con solución piraña); ii) silanización con dos silanos distintos, 3-cloropropil- trietoxi-silano (CPTES) y 3-glicidiloxipropil-trietoxi-silano (GPTES); iii) inmovilización de colágeno tipo I sobre las superficies previamente tratadas. El estudio se llevó a cabo por medio de diferentes técnicas de caracterización: interferometría de luz blanca, ángulo de contacto, ToF SIMS, XPS, microscopia óptica de fluorescencia, OWLS y AFM, identificándose los cambios físico-químicos generados en la superficie en cada una de dichas etapas, que influyen en la inmovilización del colágeno en términos de cantidad, estabilidad y conformación. De los resultados obtenidos, cabe destacar que a) la activación por plasma generó una mayor cantidad de grupos OH- en superficie; b) a mayor cantidad de grupos OH-, mayor cantidad de moléculas de silano enlazadas; c) el colágeno tipo I se adhierió en mayor cantidad y es más estable sobre las muestras en las que se enlazó mediante la química de los silanos, en especial sobre las muestras previamente tratadas con piraña donde la nanorugosidad generada por este tratamiento tiene un papel importante y d) la cantidad de colágeno adherido sobre el titanio silanizado con CPTES es superior a la obtenida con GPTES. Una vez obtenidas las superficies biofuncionalizadas, se evaluó la influencia del colágeno tipo I sobre la respuesta de células fibroblásticas humanas, en términos de adhesión, proliferación y expresión génica. En general los fibroblastos mostraron mejor adhesión, mayor proliferación y sobreexpresión de los genes asociados con la activación de los fibroblastos, así como con la secreción y la remodelación de la matriz extracelular, sobre las muestras funcionalizadas con colágeno tipo I que en las muestras control. Además, los fibroblastos sembrados sobre el grupo de muestras previamente tratadas con plasma (PL-col, PL-CP-col, PL-GP-col) mostraron una mejor adhesión así como una mayor sobreexpresión y una anticipación de la expresión génica, que el grupo de muestras previamente tratadas con piraña (PH-col, PH-CP-col, PH-GP-col). Esto se atribuyó a que la rugosidad generada por el tratamiento de piraña, disminuye la respuesta de las células fibroblásticas. El orden de la expresión de estos genes en las muestras de plasma de mayor a menor fue PL-CP-col > PL-col > PL-GP-col. La conformación del colágeno sobre las superficies se evaluó a partir de soluciones muy diluidas, mediante AFM, revelándose que la química de la superficie afecta a la conformación que el colágeno adopta. Se observó una conformación en forma de fibrillas entrecruzadas sobre las muestras de PL-col y sobre las muestras de PL-CP-col, mientras que sobre las muestras de PL-GP-col se observó una conformación en forma de agregados globulares. Estos resultados se complementaron con la cuantificación del colágeno adherido mediante OWLS, observándose que la cantidad de colágeno adherido también dependía de la química de la superficie. Se observó que las muestras silanizadas con GPTES presentaron una mayor cantidad de colágeno adherido cuando las muestras fueron sumergidas en soluciones de colágeno con baja concentración. Ambas cosas a su vez influyen en la respuesta de las células, donde se observó que a bajas concentraciones, la conformación del colágeno en forma globular obtenida sobre las muestras silanizadas con GPTES favoreció la respuesta de los fibroblastos. Finalmente, a altas concentraciones se observó que la respuesta celular no se vio influenciada ni por la cantidad ni por las diferentes morfologías de colágeno observadas sobre cada superficie, debido a que se obtuvo un mayor recubrimiento del sustrato que enmascaró el efecto que las diferentes conformaciones de colágeno podían tener sobre las células.