Disseminació i traçabilitat de la contaminació viral en conques fluvials = Dissemination and source tracking of viral contamination in river catchments

Abstract

Aquesta Tesi Doctoral ha estat pensada per avaluar, mitjançant l’estudi de virus contaminants, l’origen de la contaminació fecal i l’avast de la disseminació a l’aigua. Amb aquesta finalitat s’han utilitzat eines moleculars per a la detecció i quantificació de virus especifics humans, bovins i porcins i a més a més s’ha desenvolupat una nova eina per traçar la contaminació ovina a l’ambient. Els principals agents virals amb risc per als humans són d’origen humà però les femtes animals, amb potencials patògens zoonòtics, representen també un risc per a la salut humana. La intensificació de la producció animal o l’increment de plujes torrencials previst amb els escenaris proposats per al canvi climàtic presenten nous reptes per al control de la contaminació fecal a l’aigua. Bona part de la Tesi, ha anat lligada al projecte europeu VIROCLIME permetent dur a terme estudis a nivell internacional. S’ha caracteritzat la disseminació de virus humans contaminants a l’aigua d’un riu situat en una conca Mediterrània. Mitjançant el registre de variables hidro-climàtiques, la recollida de mostres d’aigua de riu, aigua de mar i aigua residual, i l’anàlisi de FIB i virus indicadors de contaminació fecal humana (HAdV i JCPyV), virus patògens (NoVGII, HEV), i un virus emergent (MCPyV), s’ha estudiat durant un any, l’impacte que l’aigua residual crua o els efluents de les depuradores tenen en la qualitat microbiològica del riu. En un segon estudi realitzat conjuntament amb laboratoris de Suècia, Grècia, Hongría i Brasil, s’ha pogut estandarditzar el mètode de floculació amb llet descremada, per a la concentració de virus, i els assajos de qPCR per identificar i traçar l’origen de la contaminació fecal a l’aigua. Durant 18 mesos de mostrejos a conques de rius situats a les regions Mediterrània, Àrtica, Continental i Tropical, s’han identificat virus humans (HAdV i JCPyV), bovins (BPyV) i porcins (PAdV), demostrant que aquestes eines virals són fiables i útils per a qualsevol àrea geogràfica o matriu d’aigua.

Fins al principi d’aquesta tesi, només es disposava de marcadors virals de contaminació fecal porcina i bovina. Analitzant mostres de femta i orina d’ovella, amb un assaig de PCR d’ample espectre per a la detecció de poliomavirus, es van obtenir per primera vegada seqüències d’un putatiu nou poliomavirus oví. A partir d’aquí, s’han dissenyat dos assajos de PCR específics per poder traçar la contaminació fecal ovina a l’ambient. Arrel d’aquest treball, durant l’últim any de la tesi, es va plantejar una estada a Nova Zelanda perquè es tracta del país amb més ovelles per càpita i representa bona part de la indústria ramadera del país. Traçar i identificar l’origen de la contaminació fecal animal a l’aigua és doncs bàsic, tant per la gestió dels residus com per l’avaluació dels riscos per a la salut humana. El quart estudi inclòs a la tesi, es va dissenyar per identificar les fonts principals de contaminació fecal i avaluar, al mateix temps, les diferents eines de MST utilitzades a Nova Zelanda i al laboratori de la doctoranda. S’han recollit mostres de riu als territoris ramaders més importants de l’illa del sud, i s’han analitzat E. coli, virus específics indicadors de contaminació fecal humana (HAdV, JCPyV) bovina (BPyV) i ovina (OPyV), marcadors bacterians específics d’humans (BacH, BacHum-UCD, BiAdo) i de remugants (BacR) i esterols i estanols indicadors de contaminació fecal humana o de remugant.

This thesis was designed to evaluate, through the study of viruses, the source of the fecal contamination and its spread in water matrices. For this purpose molecular tools have been used for the detection and quantification of specific human porcine and bovine viruses, and a new tool has been developed to trace ovine pollution in the environment. Human waterborne viruses pose the main risk to humans, but animal feces, with potential zoonotic pathogens, also represent a risk to human health. The intensification of animal production and the predicted scenarios for climate change, with increase of torrential rains, present new challenges for the control of fecal contamination in water .

Much of this work has been linked to the European project VIROCLIME allowing studies conducted worldwide. We characterized the spread of contaminant human viruses in a Mediterranean river basin . By recording hydro-climatic variables, collecting samples of river water, sea water and wastewater, and analysing FIB and human virus indicators of fecal pollution (HAdV and JCPyV), pathogenic viruses (NoVGII , HEV) and an emerging virus (MCPyV) we have studied, thoughouth a year, the impact of raw wastewater and efluents from the wastewater treatment plants the microbiological quality of the river. In a second study, conducted with laboratories in Sweden, Greece, Hungary and Brazil, we standardized the viral concentration method, Skimmed Milk Flocculation, and specific qPCR assays to identify and trace the origin of contamination in water. During an 18 months sampling period, in river basins located in the mediterranean region, arctic, continental and tropical regions, we identified human (HAdV and JCPyV), bovine (BPyV ) and porcine viruses (PAdV), demonstrating that these tools are reliable and useful for any geographic area or water matrix.

At the beginning of this thesis, only porcine and bovine viral fecal indicators were available to trace fecal pollution. Since no ovine viral indicator was described before the present work, we designed a study to develop a new tool to trace sheep fecal contamination. Firstly we analyzed urine and stool samples from sheep, with a broad spectrum PCR assay for the detection of polyomavirus. We obtained sequences of a putative new ovine polyomavirus and designed two PCR assays specific for the new ovine virus. During the last year of the thesis raised a stay in New Zealand because it is the country with more sheep per capita and represents much of the livestock industry in the country. Trace and identify the source of animal fecal contamination in water is therefore essential for both waste management for the evaluation of risks to human health. The fourth study included in this thesis was designed to identify the main sources of fecal contamination and evaluate the same time , the different tools used MST in New Zealand and the student laboratory. River samples were collected at major livestock areas south of the island , and analyzed E.coli , viruses specific indicators of human fecal contamination (HAdV, JCPyV) bovine (BPyV) and sheep (OPyV) specific bacterial markers in humans (BacH, BacHum-UCD, BiAdo) and ruminants ( BacR) and sterols and stanols indicators of human fecal contamination or ruminants.