Implicación de la glicosilación en el ensamblaje del flagelo y las fimbrias de Aeromonas hydrophila AH-1

Abstract

El género Aeromonas está constituido por bacilos gram negativos y comprende patógenos de animales poiquilotermos y oportunistas en humanos. La virulencia de Aeromonas hydrophila AH-1 es multifactorial, siendo el lipopolisacárido (LPS), el flagelo (polar y lateral) y la lámina S importantes factores de patogenicidad. La mutación del gen wbpL, implicado en la biosíntesis del antígeno O del LPS, da lugar a la pérdida de antígeno O, una bajada en el peso molecular de las flagelinas polares y la aparición de fimbrias en la superficie bacteriana. Se procedió a estudiar si las flagelinas polares y laterales de la cepa AH-1 se hallaban glicosiladas. Los análisis mediante LC-MS mostraron que las flagelinas laterales de la cepa AH-1 no se hallaban glicosiladas, mientras que las polares se hallaban glicosiladas con un glicano de 403 Da, derivado del ácido pseudamínico y otro glicano de 1060 Da, que no se encontraba en el mutante del gen wbpL. Este dato, junto con el hecho de que el mutante del gen rmlB que codifica para la biosíntesis de ramnosa (azúcar que compone el antígeno O) también pierde el glicano de 1060 Da, muestra la relación entre dicho glicano y el antígeno O del LPS. Asimismo se procedió a localizar los genes implicados en la síntesis de pseudamínico, adyacentes a la región 2 de flagelo polar; mutaciones tanto en alguno de estos genes (pseI, pseB) como en la glicosiltransferasa maf-1 abolía la presencia de flagelo polar pero no del lateral, demostrando así una regulación post-traduccional de las flagelinas polares mediante la glicosilación. También se observó la aparición de fimbrias. Se procedió a analizar las fimbrias que se inducían en los mutantes wbpL, pseI, pseB y maf-1. Se trata de fimbrias de tipo IV, denominadas MSHA por su homología a las descritas en Vibrio spp y ampliamente distribuidas en el género Aeromonas. La secuenciación de la agrupación mostró 22 ORF agrupadas en dos transcritos. Para analizar la inducción de las fimbrias en los mutantes se realizaron análisis de promotores, RT-PCR y detección mediante anticuerpos, que mostraron que la cepa salvaje AH-1 presenta las fimbrias pero no es capaz de ensamblarlas correctamente y las libera al exterior. La acumulación de azúcares activos en los mutantes parece ser el detonante para la expresión de estas fimbrias que juegan un papel fundamental en la formación de biofilms, favoreciendo la persistencia de la bacteria en el medio ambiente.

The genus Aeromonas is composed of Gram-negative rod-shaped bacteria and comprises opportunistic and primary pathogens of poikilothermic and homeothermic animals, including humans. The lipopolysaccharide (LPS) and S layer are important virulence factor of Aeromonas hydrophila AH-1. Mutation of the gene wbpL, which is involved in the O antigen synthesis of the LPS, leads to loss of the O antigen, a lesser molecular weight of the polar flagella and the appearance of fimbriae on the bacterial surface. It was studied whether the polar and lateral flagella of the strain AH-1 appear glycosylated. The LC-MS analysis showed that the lateral flagella were not glycosylated, while polar flagella were carrying a 403 Da glycan, derived from pseudaminic acid, as well as a 1060 Da glycan that was not found in the wbpL mutant strain. This finding, together with the fact that a mutant of the rmlB-gene, which plays a role on ramnose-biosynthesis (a sugar of the O antigen), also loses the glycan of 1060 Da, shows the involvement of this glycan in the o antigen of the LPS. It was proceeded to identify the genes in pseudaminic-synthesis adjacent to region 2 of the polar flagellum genes. Mutations in some of these genes (pseI, pseB) as well as in glycosyltranferase maf-1 abolished the presence of polar but nor of lateral flagella and therefore showed a posttranslational regulation of the polar flagellins by glycosylation. As also fimbria formation was observed it was proceeded to analyse the fimbria that were induced in the mutants of wbpL, pseI, pseB and maf-1. They were identified as type IV fimbria, also called MSHA due to their homology to those observed in Vibrio ssp and broadly distributed in the genus Aeromonas. DNA-sequencing showed 22 ORF that were organized in 2 transcripts. To analyze the induction of the fimbria in above mentioned mutants, promoter analysis, RT-PCR and immunodetection was performed. This showed that wildtype AH-1 also expresses fimbria, but is not capable of assembling them correctly and therefore expulses them to the exterior. The accumulation of active sugars in the mutants seems to trigger the correct assembly of the fimbria that play an fundamental role in biofilm formation and therefore favor the persistence of the bacteria in the environment.