Marcadores de irritación en modelos celulares y organotípicos como alternativa a los ensayos in vivo, aplicado al estudio de tensioactivos del tipo lipoaminoácido

Abstract

Los tensioactivos son unos compuestos químicos que debido a sus propiedades fisicoquímicas pueden provocar irritación. Por tanto, es interesante desarrollar nuevos compuestos que sean más biocompatibles que los tensioactivos comerciales que se utilizan actualmente. Por otro lado, los ensayos de Draize, basados en la utilización de animales, son los únicos métodos aceptados oficialmente para valorar la irritación antes de la comercialización de nuevos compuestos. No obstante, por motivos éticos y científicos existe la necesidad de disponer de métodos que permitan remplazar los animales de experimentación en esos ensayos toxicológicos. Por ese motivo, se ha estudiado el potencial efecto irritante ocular y dérmico de nuevos tensioactivos derivados de aminoácidos utilizando distintos métodos alternativos a la experimentación animal. <br/>Para valorar la irritación ocular se ha utilizado, en primer lugar, el ensayo de hemólisis basado en un modelo celular. Según este ensayo, los lipoaminoácidos son menos irritantes oculares que los tensioactivos comerciales utilizados como referencia. También se ha valorado la irritación ocular mediante los ensayos HET-CAM y CAM-TBS que se basan en un modelo organotípico, la membrana corioalantoidea del huevo de gallina. A efectos comparativos también se realizó el ensayo de Draize ocular con algunos de los compuestos. Los resultados del ensayo in vivo han revelado que la membrana corioalantoidea del huevo de gallina es un modelo demasiado sensible a los tensioactivos por lo que se descarta su utilización para valorar ese tipo de compuestos. <br/>Para valorar la irritación dérmica se ha utilizado el cultivo en monocapa de líneas celulares y se han analizado diversos marcadores de irritación. En primer lugar, se valoró la citotoxicidad inducida por los compuestos mediante dos ensayos (NRU y MTT) y se calcularon las concentraciones de tensioactivo que inhibían un 50 % la viabilidad celular (CI50). A partir de esos resultados, se ha propuesto un modelo de predicción en la línea de fibroblastos 3T3: compuestos con una CI50 inferior a 50 µg/ml presentan un potencial irritante elevado, compuestos con una CI50 entre 50 y 100 µg/ml son irritantes moderados, y compuestos con una CI50 superior a 100 µg/ml presentan un potencial irritante bajo. También, se ha estudiado la producción de interleucina 1 alfa, un mediador proinflamatorio, en la línea de queratinocitos NCTC 2544. Según los resultados, los lipoaminoácidos tienen una menor capacidad para inducir la neosíntesis de la citocina que los tensioactivos comerciales, por tanto, presentan una menor capacidad para desencadenar una respuesta inflamatoria. Por último, se ha analizado la acumulación de lípidos neutros intracelulares como posible marcador de irritación dado que desempeñan un papel muy importante en la reparación de la membrana celular cuando esta sufre algún tipo de agresión. Se ha estudiado en la línea celular NCTC 2544 tras el tratamiento con los diferentes tensioactivos. Para la detección de los lípidos neutros se utilizó el colorante rojo de nilo que es específico de lípidos neutros y se realizó el análisis mediante citofluorometría y microscopia de fluorescencia. Los tensioactivos indujeron incrementos de fluorescencia con un perfil concentración dependiente. Además, los incrementos de fluorescencia se detectaron antes de observar incrementos en la actividad lactato deshidrogenasa en el medio de cultivo, un marcador de daños sobre la membrana. Ese hecho implica que la acumulación de lípidos neutros es un marcador que indica daños sobre la membrana previo a la muerte celular. Finalmente, a efectos comparativos también se ha realizado el ensayo de Draize dérmico con algunos de los compuestos. Según este ensayo los lipoaminoácidos se clasificaron como ligeramente irritantes. Además, los resultados revelaron que los ensayos in vitro son más sensibles y permiten detectar pequeñas diferencias en el potencial irritante de los compuestos, sobretodo cuando se trata de compuestos con un potencial irritante ligero y moderado.

Surfactants are among the most versatile and frequently used excipients in cosmetic and pharmaceutical products. However, the application of pharmaceutical or cosmetic preparations containing these compounds may result in eye and skin irritation. Therefore, it is of great interest to identify surfactants with low irritant properties and it is also necessary to have rapid assays to assess potentially damaging effects. The evaluation of the irritant potential of chemicals in vivo is traditionally conducted on rabbits using the Draize test method. However, due to increasing concern over animal use and in lights of its potential ban in the near future, in vitro alternative methods should now be encouraged. The purpose of this work was to evaluate the potential eye or skin irritation of new amino acid-based surfactants using different in vitro assays. <br/>For predicting eye irritation the red blood cell test was used. According to the results of this assay, the new surfactants were less toxic than the commercial surfactants employed as a reference. Two methods based on the chorioallantoic membrane were also used. The results showed that these methods are oversensitive to this class of compounds, therefore, their utilization for predicting the eye irritation potential of surfactants is not recommended. <br/>For predicting skin irritation, different cell lines (fibroblasts 3T3 and 3T6, keratinocytes NCTC 2544 and HaCaT) were employed taking into account different endpoints, such as cell viability, IL-1alpha production and lipid droplet accumulation. Cell viability was measured using two different assays (NRU and MTT) and we proposed a prediction model taking into account the IC50 values. The release and production of the cytokine IL-1alpha was measured in the NCTC 2544 cell line. The results revealed that new surfactants are less potent than the commercial surfactants to stimulate the synthesis of the cytokine. Lipid droplet accumulation was also studied in the NCTC 2544 cell line. After the surfactant exposure, cells were treated with Nile Red. The results of the fluorescence measurements showed a concentration dependent profile for all the compounds. Furthermore, fluorescence increases were detected before significant lactate deshidrogenase release into the culture medium was observed. Accordingly, the accumulation of lipid droplets could be used to detect membrane injuries prior to cell death.