Implicación de los metabolitos del ácido araquidónico producidos por las lipoxigenasas y citocromos P-450 sobre la proliferación de los fibroblastos 3T6

Abstract

Estudios previos demostraron que la disminución de la liberación del ácido araquidónico (AA) bloqueaba la proliferación de los fibroblastos 3T6 inducida por suero fetal. Además, la inhibición de las ciclooxigenasas (COXs) producía una reducción parcial de la proliferación celular, mientras que los antagonistas receptoriales de la prostaglandina (PG) E2 bloqueaban casi completamente el crecimiento de los fibroblastos 3T6. Estos resultados sugirieron la implicación de los metabolitos del AA producidos a través de otras vías como la de las lipoxigenasas (LOXs), que produce leucotrienos (LTs) y ácidos hidroxiecosatetraenoicos (HETEs), o la de los citocromos P-450 (CYPs), que forma HETEs y ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs). El objetivo de nuestro trabajo fue estudiar la implicación de estas vías sobre el control de la proliferación de los fibroblastos 3T6. <br/>Nuestros resultados han sugerido que el suero induce la síntesis de PGE2 y 12(S)-HETE en los fibroblastos 3T6, mientras que los niveles de LTB4 son muy bajos y se encuentran en el límite de detección. Por otro lado, los inhibidores específicos de la 5-LOX (zileuton) y de la 12/15-LOXs (baicaleína), y los antagonistas de los receptores de los LTs (U-75302, REV-5901, LY-171883) no inhibieron de forma significativa el crecimiento de los fibroblastos 3T6 ni la incorporación de timidina. Sin embargo, en los macrófagos RAW 264.7, estos mismos tratamientos fueron capaces de inhibir la proliferación celular y la incorporación de timidina, y el zileuton produjo un retraso en el ciclo celular, sin inducir citotoxicidad o apoptosis. Estos resultados sugieren la implicación de la 5-LOX y los receptores de los LTs en el control de la proliferación de los macrófagos RAW 264.7. Por otro lado, nuestros resultados demuestran que la adición exógena de LTB4 o LTD4, en ausencia de suero, induce un incremento del crecimiento y de la incorporación de timidina en los macrófagos RAW 264.7, y este efecto está mediado por la activación de las vías MAPK y PI3K/Akt. El EPA compite con el AA para ser metabolizado por la COX-2, formando PGE3, y por la 5-LOX, dando lugar al LTB5. Nuestros resultados demuestran que la PGE3 y el LTB5 estimulaban la proliferación de los macrófagos con una potencia similar a la de la PGE2 y LTB4. Dado que la vía de las LOXs no parecía implicada en el control de la proliferación de los fibroblastos 3T6, se centró nuestro interés en estudiar los metabolitos del AA producidos por los CYPs. Nuestros resultados demostraron que inhibidores de los CYPs como el SKF-525A, 17-ODYA, ABT o PPOH inhibieron la síntesis de 12(S)-HETE, el crecimiento celular y la síntesis de DNA. Además, el 5-HETE, 12(S)-HETE, 15(S)-HETE y 20-HETE revertieron la inhibición del crecimiento celular inducida por el SKF-525A, mientras que el 11,12-EET no lo hizo. Además, nuestros resultados mostraron que en ausencia de factores de crecimiento, el 5-HETE, 12(S)-HETE y 15(S)-HETE inducen el crecimiento de los fibroblastos 3T6 y la síntesis de DNA, y en este efecto estaba implicada la activación de la vía PI3K/Akt. Por otro lado, la adición exógena de 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET, 5,6-DHETE o 11,12-DHETE inhibió la proliferación de los fibroblastos 3T6 y la incorporación de timidina inducida por PDGF. Además, sugerimos que estos metabolitos son pro-apoptóticos ya que aumentan la externalización de la fosfatidilserina, la actividad caspasa total y la fragmentación de la cromatina nuclear. Finalmente, observamos que los EETs como el 11,12-EET y 14,15-EET aumentaron la actividad caspasa-3 y caspasa-12 en los fibroblastos 3T6. En resumen, la proliferación de los fibroblastos 3T6 estaría regulada por los metabolitos del AA producidos por la vía de las COXs y por la vía de los CYPs. En este último caso, están implicados los HETEs con efecto proliferativo, y los EETs, con efectos anti-proliferativo y pro-apoptótico.

<i>Free arachidonic acid (AA) can be metabolized by three pathways: the cyclooxygenases (COXs), which produces prostaglandins (PGs) and thromboxanes; the lipoxygenases (LOXs), which forms leukotrienes (LTs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs) and lipoxins; and the cytochrome P450 monooxygenases (CYPs), which pruduces hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs) and epoxyeicosatrienoic acids (EETs). Finally, the cytosolic epoxide hydrolases catalyze a rapid enzymatic hydration of the EETs to dihydroxyeicosatetraenoic acids (DHETEs). Previous studies demonstrated the role of AA metabolites derived through cyclooxygenase pathway on 3T6 fibroblast growth. These results suggested the implication of other pathways such as LOX or CYP in this function. Therefore, the aim of this thesis was to study the role of AA metabolites derived through LOX or CYP activity on 3T6 fibroblast growth. Our results showed that LOX pathway is not important in the control of 3T6 fibroblast proliferation, while LOX inhibitors and LT receptor antagonists blocked RAW 264.7 macrophage growth. Moreover, in the absence of serum, LTB4 and LTD4 increased RAW 264.7 macrophage proliferation through MAPK and PI3K/Akt pathways activation. On the other hand, CYP inhibitors reduced cell growth, thymidine incorporation and 12(S)-HETE synthesis on 3T6 fibroblasts. Furthermore, 5-HETE, 12(S)-HETE, 15(S)-HETE and 20-HETE reverted the cell growth inhibition induced by the CYP inhibitor SKF-525A. In the absence of growth factors, 5-HETE, 12(S)-HETE and 15(S)-HETE increased cell growth and thymidine incorporation through PI3K/Akt pathway activation. However, exogenous addition of 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET, 5,6-DHETE or 11,12-DHETE inhibited 3T6 fibroblast growth and thymidine incorporation induced by PDGF. Moreover, these metabolites were pro-apoptotic increasing phosphatidylinositol externalization, total caspase activity and DNA fragmentation. Finally, we observed that EETs such as 11,12-EET and 14,15-EET increased caspase-3 and caspase-12 activity. In summary, 3T6 fibroblast growth is regulated by metabolites derived from AA-COX and AA-CYP, the last mentioned includes HETEs which have proliferative effect and EETs wich have anti-proliferative and pro-apoptotic effects.<br/></i>