Anàlisi funcional de la proteïna Scp160 de

Abstract

Scp160 és una proteïna de <i>Saccharomyces cerevisiae</i> que conté 14 dominis KH de tipus I, un domini conservat present en un gran nombre de proteïnes. Scp160 presenta homologia amb la proteïna de metazous coneguda com a vigilina. Aquestes proteïnes es troben conservades en el grup dels fongs i els metazous. Les vigilines han sigut associades en diferents processos cel·lulars entre els que cal destacar: la regulació general de la síntesi proteica, la estabilització de mRNAs específics i la contribució a la segregació dels cromosomes en mitosi.<br/>La vigilina de <i>Drosophila melanogaster</i>, la proteïna DDP1, va ser aïllada en el nostre laboratori com una proteïna associada a la heterocromatina pericentromèrica d'aquest organisme. Donada la conservació d'aquestes proteïnes entre els fongs i els metazous ens em plantegat l'estudi de la possible contribució de la proteïna Scp160 en la formació i manteniment de la heterocromatina de <i>S. Cerevisiae</i>.<br/>Les cèl·lules mutants <i>scp160</i> presenten, en ser analitzades per FACS, nivells de ploidia aberrants suggerint la presencia de problemes en el procés de segregació cromosómica d'aquestes cèl·lules. Consistent amb la presencia de alteracions en al procés de segregació cromosòmica les cèl·lules <i>scp160</i> presenten hipersensibilitat a drogues desestabilitzadores de microtubuls com el benomyl. La expressió de la proteïna DDP1 de forma ectópica en cèl·lules de <i>S. Cerevisiae</i> es capaç de complementar la manca de la proteïna Scp160 indicant que ambdues proteïnes no només són homòlegs estructurals, sinó que també són homòlegs funcionals.<br/>Per tal de analitzar la contribució de la proteïna Scp160 a la estructuració de la heterocromatina als diferents loci silenciats que hi ha en el genoma de <i>S. Cerevisiae</i>, per això hem realitzat la deleció del gen <i>SCP160</i> en soques que portaven marcadors inserits en les regions telomèriques, els <i>locus</i> silenciats del <i>mating type</i> i el <i>locus</i> del rDNA, observant-se que la deleció del gen <i>SCP160</i> es comporta com un supressor de variegació en les seqüències telomèriques i en el <i>locus</i> del <i>mating type</i>, preo no té cap efecte en el silenciament del <i>locus</i> del rDNA.<br/>Consistent amb el efecte de desrepresió observat en les seqüències telomèriques la mutació <i>scp160</i> presenta una desregulació en la longitud de les seqüències telomèriques, suggerint una implicació d'aquesta proteïna en el manteniment d'aquestes seqüències.<br/>Per tal de aprofundir en el defecte de silenciament que presenten les cèl·lules mutants <i>scp160</i> hem estudiat mitjançant CHIP la presència de la proteïna Sir3 en les regions telomèriques de les cèl·lules mutants, observant-se una disminució significativa dels nivells de Sir3 en comparació amb cèl·lules <i>wild type</i>. Consistent amb aquest efecte la sobreexpresió de la proteïna Sir3 es capaç de recuperar la pèrdua de silenciament telomèric observat en les cèl·lules <i>scp160</i>. Així mateix el fenotip de desrepresió associat a la deleció del gen <i>SCP160</i> no s'estableix en cèl·lules que sobreexpressen Sir3 o que presenten mutacions que reforcen el silenciament telomèric, com la mutació de la histona desacetilasa Rpd3 o de les proteïnes telomèriques Rif1 i Rif2.<br/>Tots aquest resultats no ens permeten discernir entre una implicació directa de la proteïna Scp160 en aquest processos o una acció indirecta deguda a la regulació d'altres processos cel·lulars. La proteïna Scp160 presenta una localització perinuclear compatible amb la presència d'aquesta proteïna a les seqüències heterocromàtiques de <i>S. Cerevisiae</i>, però no ha pogut ser localitzada en les regions telomèriques d'aquest organisme mitjançant CHIP. Són necessaris estudis posteriors per a determinar la presència d'aquesta proteïna en les regions heterocromàtiques d'aquest organisme.<br/><br/><br/>ENGLISH

Vigilins are highly conserved proteins found in fungi and metazoan. Vigilins contains 14-15 KH domains, a protein domain involved in single stranded nucleic acids binding.<br/><i>Drosophila melanogaster </i>vigilin, the protein DDP1, was isolated in our lab as a protein associated with pericentric heterochromatin. As these proteins are conserved among fungi and metazoan, we wanted to study the possible implication of Scp160, Saccharomyces cerevisiae vigilin, in the formation and maintenance of heterochromatin.<br/>Mutants cells <i>scp160</i> shows aberrant DNA content upon analysis with FACS. Consistent with alterations in the chromosome segregation process, these cells show hypersensitivity to benomyl, a microtubule depolymerising drug. Ectopic expression of Drosophila DDP1 in yeast cells was able to complement <i>scp160</i> mutation in yeast. <br/>In order to analyse the contribution of Scp160 to heterochromatin formation we have deletes SCP160 gene in strains bearing markers at different loci that are silenced in the <i>Saccharomyces cerevisiae</i> genome: telomeric regions, mating type locus and rDNA locus. We have seen that SCP160 deletion behaves like a suppressor of variegation in telomeric and mating type region, but not in rDNA region.<br/>Scp160 protein shows perinuclear localization compatible with its presence in heterochromatic regions, but we could not detect this protein in the telomeric regions by chromatin immunoprecipitation experiments.