Angiogènesi al Melanoma Maligne. Anàlisi de l'efecte de l'estimulació amb Matrigel, de la relació amb l'expressió del Factor de Creixement de l'Endoteli Vascular (VEGF) i de l'efecte de la transfecció del cDNA del VEGF en sentit i antisentit sobre l'angiogènesi i el comportament tumorals. Estudi en melanomes humans i en línies de melanoma humà xenoempeltades a ratolins immunodeprimits.

Abstract

HIPÒTESI DE TREBALL.<br/> <br/>L'angiogènesi al melanoma maligne està influenciada per factors autocrins i paracrins, entre els que es troba el VEGF. La influència del VEGF és especialment significativa a les primeres fases del desenvolupament tumoral.<br/>La modificació de l'equilibri angiogènic actuant sobre el VEGF podria condicionar un canvi significatiu al creixement tumoral i la seva capacitat metastàtica.<br/><br/>OBJECTIUS.<br/><br/>1.- Valorar l'expressió de VEGF en una sèrie de melanomes malignes primaris cutanis humans de baix risc.<br/><br/>2.- Valorar el creixement tumoral i l'angiogènesi als tumors desenvolupats en ratolins atímics inoculats ortotòpicament amb les línies de melanoma humà A375P i A375MM, coinjectades o no amb Matrigel. <br/><br/>3.- Avaluar la influència de la modificació genètica de l'expressió de VEGF, mitjançant la transfecció del cDNA del VEGF en sentit i antisentit a les línies de melanoma humà A375P i A375MM, als tumors desenvolupats a ratolins atímics a partir de la injecció ortotòpica d'ambdues línies així modificades.<br/><br/>MÈTODES.<br/><br/>1.- Melanomes humans: 53 melanomes malignes cutanis primaris. Angiogènesi: tinció amb Ulex Europaeus I. Expressió VEGF: anàlisi immunohistoquímica.<br/><br/>2.- Expressió de VEGF a línies de melanoma humà xenoempeltades a ratolins immunodeprimits: Inoculació ortotòpica a ratolins Balb/c nude de les línies A375P i A375MM, la meitat coinjectades amb Matrigel. Angiogènesi: tinció immunohistoquímica amb Ac anti-factor VIII. Expressió VEGF: anàlisi immunohistoquímica.<br/><br/>3.- Modificació de l'expressió de VEGF a línies de melanoma humà xenoempeltades a ratolins immunodeprimits: Construcció del cDNA del VEGF en sentit i antisentit en un vector d'expressió (pRC/CMV), transfecció mitjançant liposomes a les línies A375P i A375MM, selecció dels transfectants i inoculació ortotòpica a ratolins atímics. Extirpació de la meitat dels tumors el més aviat possible (5-6 dies), per a avaluar la malaltia en les seves fases més precoces. Per a l'altra meitat, lliure creixement, calculant les corbes de creixement i extirpant els tumors a l'assolir un volum de 1·1 cm o equivalent. Seguiment de la supervivència dels ratolins. Angiogènesi: immunotinció amb Ac anti-factor VIII.<br/><br/>RESULTATS.<br/><br/>1.- Melanomes humans: El VEGF ha estat present al 84,9% de melanomes avaluats.<br/>Als melanomes en fase de creixement radial (in situ), a 7 de 29 s'ha observat un grau alt d'expressió de VEGF, front 12 de 16 a melanomes amb fase vertical (p=0,002). Una vegada el melanoma era ja invasor, no s'han trobat diferències entre el grau d'expressió de VEGF i el nivell de Breslow. No s'ha trobat relació entre angiogènesi i expressió de VEGF.<br/><br/>2.- Expressió de VEGF als tumors desenvolupats als ratolins inoculats: S'ha demostrat una major expressió de VEGF en els estadis més temprans del desenvolupament tumoral, representats aquests per aquells tumors més petits (<0,5 cm) o intervinguts més aviat (< 9 dies).<br/><br/>3.- Efecte de la modificació de l'expressió de VEGF sobre les dues línies A375P i A375MM xenoempeltades a ratolins atímics. Transfecció cDNA del VEGF en sentit: ha incrementat significativament el creixement dels tumors a les fases inicials del desenvolupament tumoral (4 clons de 4), a la corba de creixement (2 de 4), i a la supervivència (1 de 4). Transfecció cDNA VEGF en antisentit: cap diferència repecte al control, ni a fases inicials, ni a la corba de creixement, ni a la supervivència. Angiogènesi: no diferències en la densitat vascular entre els diferents clons.<br/><br/>CONCLUSIÓ FINAL. <br/><br/>El VEGF és determinant a les fases inicials del desenvolupament tumoral al melanoma maligne. Més endavant perd el seu paper protagonista. Igualment, la modificació genètica de la seva expressió en un model in vivo amb línies de melanoma humà xenoempeltades a ratolins atímics té efecte només als moments inicials del creixement tumoral, perdent tota la seva influència a les fases més tardanes del desenvolupament tumoral.

We hypothesized that angiogenesis in melanoma is related to VEGF, and that the modification of the expression of VEGF could influence angiogenesis, tumour growth and metastatic capacity.<br/><br/>First, we examined immunohistochemically the expression of VEGF in cutaneous primary melanoma. VEGF expression was graded in a scale from 0 to 3. Angiogenesis was measured with Ulex Europaeus I staining. <br/>84,9% of tumours expressed VEGF. Vertical Growth Phase (VGP) was significatively associated with a higher intensity expression of VEGF when comparing to radial growth phase. However, once VGP had developed, there were no differences in VEGF expression between tumours. Surprisingly, VEGF expression was not related to angiogenesis.<br/><br/>Second, in a model of human melanoma cell lines (A375P, A375MM) xenografted to nude mice, we evaluated the expression of VEGF. <br/>The most significant finding was a higher intensity expression of VEGF in tumours representing the first steps of tumour development: tumours lower than 0,5 cm in diameter and those extracted before day 9 post-inoculation demonstrated higher expression of VEGF when compared with the remainder.<br/><br/>Third, VEGF sense and antisense cDNA were cloned to an expression vector (pRC/CMV) and transfected to A375P and A375MM melanoma cell lines with cationic liposomes; modified cell lines were xenografted to nude mice. To analyse first stages of tumour progression, half of the resultant tumours were extracted when they were minimally detectable. Growth curves of the rest of tumours were measured, and they were excised when reaching a volume of 0,4 cm3. Survival curves of mice were analysed afterwards. Angiogenesis was evaluated with Factor VIII staining.<br/>Sense VEGF transfection significatively enhanced tumour growth on initial stages of development (4 clones of 4), on growth curves (2 of 4) and on survival (1 of 4). Antisense VEGF transfection did not show any difference with control clones at any stage. Angiogenesis was not different between the clones.<br/><br/>Conclusion: VEGF is decisive at first stages of development in melanoma. The modification of VEGF expression in an in vivo model of human melanoma cell lines xenografted to nude mice plays a role at initial stages of tumour development, losing its influence later.