Detección del gen

Abstract

Las cepas de <i>Escherichia coli</i> productoras de toxina Shiga han emergido recientemente como patógenos humanos, provocando graves enfermedades como la colitis hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico. Los principales factores de virulencia de estas cepas lo constituyen unas potentes citotoxinas conocidas como toxinas Shiga (codificadas por genes <i>stx</i> en el genoma de bacteriófagos atemperados), una proteína de membrana externa (intimina), responsable de la adhesión de la bacteria al epitelio intestinal y una enterohemolisina. La transmisión horizontal de los genes <i>stx</i> mediada por bacteriófagos, podría explicar la elevada diversidad de serotipos de <i>E. coli</i> portadores de estos genes.<br/><br/>El objetivo de la tesis doctoral fue el análisis de la prevalencia del gen <i>stx2 </i>en ambientes acuáticos y la detección, el aislamiento y la caracterización de las bacterias portadoras del gen, así como el estudio de los bacteriófagos portadores del gen <i>stx2 </i>integrados en estas bacterias. <br/>Se diseñó un método basado en la combinación del NMP y la PCR anidada utilizando cebadores específicos para la subunidad A del gen <i>stx2 </i> para el estudio de prevalencia. Se analizaron aguas residuales crudas municipales y de mataderos. El gen <i>stx2 </i> fue detectado en todas las muestras, observándose una relación constante entre el número estimado de cepas <i>stx2 </i>estimado independientemente del origen de la muestra. <br/>Se caracterizaron 144 cepas portadoras del gen <i>stx2 </i> aisladas mediante el método de la hibridación colonial utilizando agar chromocult y una sonda específica para el gen stx2. Asímismo, se aislaron 72 cepas de <i>E. coli</i> O157 utilizando la técnica de la separación inmunomagnética, la siembra en el medio selectivo CT-SMAC y la detección inmunológica del antígeno O157. También se analizó el patrón de digestión del lipopolisacárido. Se seleccionaron un total de 65 cepas portadoras del gen <i>stx2 </i>y 28 cepas O157, como representantes. Todas las cepas fueron clasificadas como <i>E. coli</i> mediante la galería API 20E o secuenciación del 16S rDNA. Estas cepas fueron serotipadas detectándose 36 serotipos, algunos de los cuales no habían sido identificados previamente como portadores del gen <i>stx2 </i>. Posteriormente, se analizó la resistencia a diferentes antibióticos siendo las sulfonamidas, tetraciclina, cloramfenicol, trimetroprim y estreptomicina los antibióticos que presentaron mayor número de resistencias. Todas las cepas eran portadoras de una o dos de las variantes del gen <i>stx2 </i> descritas (c, d, e y g). Respecto a otros factores de virulencia se detectó el gen <i>stx1 </i>n el 28% y 20% de las cepas aisladas de agua residual urbana y agua residual de matadero bovino respectivamente. El gen <i>eae</i> fue detectado en las cepas <i>E. coli</i> O157:H7 mientras que el gen codificante para la enterohemolisina fue detectado en el 7%, 46% y el 11% de agua residual urbana, matadero bovino, y agua residual de origen mixto, respectivamente. El gen <i>saa</i> fue detectado en 5 cepas. Se detectó la producción de proteína Stx2 en algunas de las cepas aisladas, mayoritariamente aquellas de origen bovino. En el caso de la Stx1 un mayor porcentaje de cepas que expresaban el gen. <br/>La mayoría de las cepas aisladas presentaron bacteriófagos inducibles algunos de los cuales eran portadores del gen <i>stx2 </i> (mayoritariamente cepas aisladas de agua residual de matadero bovino). Los bacteriófagos portadores de distintas variantes del gen <i>stx2 </i> presentaron variabilidad en cuanto a su capacidad de infectar a diferentes cepas huésped. Además presentaron variabilidad en los patrones RFLP y sitio de integración. Estos bacteriófagos presentaron dos morfologías diferentes: cápsides icosaédricas hexagonales con colas cortas y cápsides alargadas con colas largas. <br/>La diversidad de bacteriófagos portadores del gen stx2 observada podría contribuir a la dispersión del gen <i>stx2 </i> entre las diferentes poblaciones bacterianas.<br/><br/>ENGLISH

Shiga toxin producing <i>Escherichia coli</i> have emerged recently as human pathogens. The main virulence factors are the Shiga toxins (which are bacteriophage encoded), the external membrane protein called intimin, which is responsible for the adhesion of the bacterium to the intestinal epithelium and the hemorrhagic hemolysin.<br/>The aim of the study was to analyse the prevalence of the <i>stx2 </i> gene, the detection, isolation and characterization of the <i>stx2 </i>gene-carrying bacteria from aquatic environments and the characterization of the <i>stx2 </i> bacteriophages which are integrated in the genome of these bacteria. <br/>A combination of the NMP and the nested PCR method was used to evaluate the prevalence of the <i>stx2 </i>gene in raw municipal sewage and animal wastewater. The <i>stx2 </i> gene was detected in all the samples with a constant ratio between <i>stx2 </i> and the bacterial indicators analysed. 144 strains were isolated by colony blot hybridisation. 72 <i>E. Coli</i> O157 strains were isolated using IMS, CT-SMAC and the immunological detection of the O157 antigen. These strains were biochemically characterized and a total of 65 <i>stx2 </i> and 28 O157 strains were chosen as representatives for further studies.<br/>All the strains were identified as <i>E. Coli</i>belonging to 36 diferent serotypes. These strains antibiotics were mostly resitant to sulfonamides, tetracycline, cloramfenicol, thrimethroprim. All the strains carried one or two <i>stx2 </i>gene variants. The <i>stx1 </i>gene was detetcted in 28% and 20% of the isolated strains of urban sewage and bovine slaughterhouse. The eae gene was detected in <i>E. Coli</i>O157:H7, and the ehxA gene in 7%, 46% and 11% of municipal sewage, bovine slaughterhouse, and mixed slaughterhouse wastewater origin, respectively. The <i>saa</i> gene was detected in 5 strains. Production of Stx2 protein was detected mainly in strains from bovine origin. A greater percentage of strains expressed the <i>stx1 </i>gene. <br/>Most of the isolated strains harbored <i>stx2 </i> bacteriophages in their genome (mainly strains from bovine slaughterhouse origin), which carried different <i>stx2 </i>variants, presented variability in the RFLP analysis as well as in the infection to different hosts. The diversity of <i>stx2 </i> bacteriophages observed could contribute to the dispersion of the gene stx2 between the different bacterial populations.