Study on the Connexion 32 and its role in the release of ATP.

Abstract

The aim of this 4 year long work was to study the Connexin32 (Cx32), a protein that forms hemichannels anchored in the plasma membrane. Two hemichannels of adjacent cells form a gap junction. Mutations in Cx32 have been associated to the X-linked form of Charcot-Marie-Tooth disease, a neurodegenerative illness affecting the peripheral nervous system. Cx32 is expressed in Schwann cells, in the paranodal zones. Using Xenopus laevis oocytes to express Cx32 hemichannels, we have monitored simultaneously the release of ATP and the ionic currents. ATP in the medium was detected with luciferin-luciferase reaction and the ionic currents were recorded under two electrode voltage clamp. Depolarization of oocytes expressing Cx32, from -40mV to +80mV induced an outward current and at the end of the pulse a transitory peak of ATP release. Using Cx32 transfected HeLa cells, we captured the luminescence due to ATP release, when cells were under a hypotonic solution containing luciferin-luciferase mixture. Isotonic solution was 280 mOsm and hypotonic solution was 150 mOsm. We also studied the release of ATP in Schwann cell cultures and again the hypotonic conditions induced a rapid increase of extracellular ATP. Finally, when we repeated the voltage clamp experiments expressing Cx32 and also syntaxin 1A, we saw a partial inhibition that of the currents and the release of ATP, which didn't happen when we repeated the hypotonic shock with HeLa cells expressing Cx32 and syntaxin. In order to keep on working in the ATP release through Cx32 hemichannels and its relation with CMT disease five different mutation already described in CMTX patients were generated in the lab, to study the ATP release through Cx32 mutated hemichannels in TEVC experiments with oocytes and transfecting mammal cells. This last part is not finished but it is conyinued by a predoctoral student of Dr. Solsona.

<I>L'objectiu d'aquest treball desenvolupat Durant 4 anys ha estat estudiar la Connexina32 (Cx32), sis unitats d'aquest proteína formen un hemicanal anclat a la membrana plasmàtica, dos hemicanals de cèl·lules adjacents formen una unió tipus gap. Mutacions en la Cx32 s'han relacionat amb la forma lligada al cromosoma X de la malaltia de Charcot-Marie-Tooth, una malaltia neurodegenerativa perifèrica. La Cx32 s'expressa en molts teixits però les mutacions només afecten les cèl·lules de Schwann, on la Cx32 s'expressa als paranodes i a les cissures d'Schmidt-Lanterman. Utilitzant oòcits de Xenopus per expressar Cx32, hem mesurat l'alliberació d'ATP i la corrent generada després de sotmetre el oòcits a una despolarització. L'ATP es va detectar utilitzant els enzims luciferina i luciferasa i les corrents utilitzant el sistema de fixació de voltatge amb dos elèctrodes. Després vem estimula electricament nervi ciàtic sencer de rata i ratolí i vem poder captar alliberació d'ATP amb preferència per certes regions diferènciades. Per tal de diferenciar si aquest ATP alliberat provenia de les cèl·lules de Schwann i no dels axons de les neurones també vam estudiar l'alliberació d'ATP en cèl·lules de Schwann en cultiu i el xoc hipotònic també provoca alliberació d'ATP. Vem veure que les cèl·lules de Schwann alliberen ATP però no si ho fan a través de connexines. Primer vem realitzar inmunofuorescències per detectar la presència i posició de les connexines expressades a les cel·lules de Schwann (Cx32, Cx29 i Cx43) i vem trobar presència de Cx32 i Cx29 en les regions paranodals i a les cissures d'Schmidt-Lanterman, i Cx43 al llarg de la veina formada per la cel·lula de Schwann, amb certa preferència per les regions paranodals. Finalment, donada la periodicitat de la Cx32 era un bon candidat per l'alliberació d'ATP a través de les c'el·lules de Schwann que envolten els axons del nervi ciàtic, per veure i la Cx32 alliberava ATP vem Utilitzar cèl·lules HeLa transfectades amb Cx32 i vam capturar l'alliberació d'ATP després d'un xoc hipotònic, també utilitzant la luciferina i la luciferasa, però no vem trobar diferències entre les cèl·lules transfectades amb Cx32 i les que no ho estaven. Així, la Cx32 no allibera ATP en resposta a un estímul hipotònic, però podria en resposta a una depolarització, l'estíml fisiològic que activa l'obertura d'hemicanals de Cx32. Finalment, en experiments de fixació de voltatge expressant la Cx32 amb sintaxina 1A hi havia una inhibició parcial de les corrents d'entrada i de sortia, i de l'ATP alliberat, inhibició que no es va reproduir en els experiments de xoc hipotònic en cèl·lules HeLa transfectades amb Cx32 i sintaxina. Per seguir traballant en la línia de l'estudi de la Cx32 i l'alliberació d'ATP, i la relació que això pot tenir an el desenvolupament de la malaltia de CMT es van triar i generar cinc constructes de Cx32 humana amb mutacions diferents descrites en malalts de CMTX, per tal d'observar l'alliberació d'ATP a través d'hemicanals de Cx32 mutada tant en els experiments de TEVC amb oòctis, com en experiments amb cèl·lules de mamífer transfectades. Aquesta darrera part no va ser acabad però en l'actualitat està esssent realitzada per un altre becari predoctoral del Dr. Solsona. </i>