Estudio del silenciamiento de los genes farnesildifosfato sintasa e Ingeniería metabólica para la producción de sesquiterpenos en Arabidopsis

Abstract

La enzima FPS ocupa una posición clave en la vía del MVA, ya que a partir de sus sustratos, IPP y DAMPP, y del producto de la reacción que cataliza, FPP, se sintetizan compuestos isoprenoides imprescindibles para el crecimiento y desarrollo de las plantas, y para su relación con el entorno. A. thaliana posee dos genes FPS, AtFPS1 y AtFPS2, que codifican tres isoenzimas, FPS1L, FPS1S y FPS2. La caracterización de mutantes de A. thaliana con pérdida de función de los genes AtFPS1 y AtFPS2 demostró que la actividad FPS es esencial para el desarrollo de las plantas, ya que el doble mutante Atfps1:Atfps2 presenta letalidad embrionaria. La letalidad embrionaria del doble mutante hizo imposible estudiar en profundidad la función y los mecanismos de regulación en los que se encuentran implicadas las isoenzimas FPS en las plantas adultas. En el Capítulo de esta tesis doctoral se atenuó la expresión de los genes AtFPS empleando una estrategia de silenciamiento inducible basada en el uso de microRNAs artificiales (amiRNA). Se obtuvieron líneas mutantes de fps condicionales en donde se observó una importante reducción en los niveles de mRNA, proteína y actividad FPS, un fenotipo de clorosis y una reducción importante del tamaño especialmente en la raíz, una reducción significativa en los niveles de los esteroles mayoritarios, un aumento de la actividad HMGR, una disminución en el número, el tamaño de los cloroplastos, en conjunto con una dramática alteración en la organización de los cloroplastos y una reducción en los niveles de clorofilas y carotenoides. Además el estudio de la expresión génica global mediante RNA‐seq identificó importantes grupos de genes desregulados asociados a la homeostasis de Fe, al metabolismos antioxidante GST y a la vía de señalización del JA. Todos estos antecedentes sugieren que el bloqueo en la síntesis de FPP, además de la reducción de los niveles de isoprenoides citosólico, desencadena a través de mecanismos aún desconocidos, una respuesta que interconectan la vía de isoprenoides, ubicada en el citosol, con el cloroplasto. Este trabajo representa la primera aproximación transcriptómica sobre la función de los genes AtFPS, la cual entrega datos relevantes acerca de su efecto sobre la expresión génica global y por lo tanto, sobre su interacción en otros procesos esenciales para la planta hasta completamente desconocidos.

Por otro lado, en el Capítulo II se abordó una serie de estrategias para la producción en el citosol de nerolidol, componente de la HIVPs considerado uno de los volátiles de interés ecológico y económico, por su capacidad para atraer insectos carnívoros. Trabajos previos apuntaban a que la limitante para incrementar la producción de este compuesto en el citosol atendía a la disponibilidad del sustrato FPP. Esto puede explicar el bajo rendimiento obtenido en diversos intentos realizados para producir sesquiterpenos en el citosol mediante la expresión de diferentes sesquiterpeno sintasas. En cambio, la expresión de sesquiterpenos sintasas en otros compartimientos celulares, como el cloroplasto y la mitocondria, ha permitido superar los mecanismos homeostáticos que limitan la disponibilidad del FPP citosólico, a pesar de que las sesquiterpeno sintasas son enzimas que habitualmente se encuentran en el citosol. En este contexto, mediante la expresión transitoria en hojas de N. benthamiana de las diferentes versiones de la sesquiterpeno sintasa FaNES1 anclada a las membranas del RE, se observó un incremento de la producción de nerolidol en el compartimento citosólico. Además se utilizaron enzimas bifuncionales FPS1/FaNES1 que permitieron la producción de nerolidol en el citosol. Todos estos resultados sugieren que la síntesis de nerolidol depende esencialmente de los niveles de proteína FaNES1, lo que indica que la limitación para la producción de sesquiterpenos en este compartimento es un problema de estabilidad de la proteína y no de disponibilidad de sustrato.

"Study of gene silencing synthase and farnesyl Metabolic engineering for production of sesquiterpenes in Arabidopsis"

In the first chapter of this thesis, the expression of AtFPS genes was attenuated using an inducible silencing strategy based on the use of artificial microRNAs (amiRNA). fps conditional mutant lines showed a significant reduction in the levels of mRNA, protein and FPS activity. Silenced plants displayed a chlorotic phenotype and a significant reduction in the size especially in the root. A significant reduction in the levels of the major sterols was observed unless HMGR activity was significantly induced. Mutant plants showed a reduction in chloroplasts number and size which in conjunction resulted in a dramatic alteration in chloroplasts organization and a reduction of chlorophylls and carotenoids levels. Furthermore, the study of global gene expression by RNA‐seq led us to the identification of groups of deregulated genes involved in Fe homeostasis, GST metabolism and JA signaling pathway. Our data suggests that blocking the synthesis of FPP, through yet unknown mechanisms, generates a response that connect isoprenoid production in both the cytosol and the chloroplast.

In Chapter II we have developed several strategies for the production of nerolidol in the cytosol, a typical sesquiterpene produced by HIPVs. We have achieved an increased production of nerolidol in the cytosol when overexpressing different versions of FaNES1 sesquiterpene synthase anchored to the ER membranes in N. benthamiana leaves. Furthermore, FPS1/FaNES1 bifunctional enzyme also enabled the efficiently production of nerolidol in the cytosol. Both FaNES1 anchored in the ER membranes as well as the cytosolic expression of a fusion protein with GFP or FPS1S isoform tremendously increase the enzyme stability and gave rise to the production of nerolidol. Our results indicate that the production of nerolidol in the cytosol essentially depends on FaNES1 protein levels, suggesting that the limitation for the production of sesquiterpenes in this compartment is a problem of stability of the protein rather than substrate availability.