Caracterització de biofilms fototròfics d'ambients hipogeus

Abstract

L'objectiu principal d'aquest treball experimental ha estat l'estudi dels biofilms fototròfics d'ambients hipogeus, el que ens ha permès d'aprofundir sobre les tècniques d'observació, els organismes i el monitoratge de les comunitats fotosintètiques que s'hi desenvolupen. S'han posat a punt i/o s'han millorat tècniques per examinar l'estructura tridimensional dels biofilms i per identificar els microorganismes i llurs pigments fotosintètics. Amb la informació obtinguda, s'han assajat mètodes per al control i la prevenció del seu desenvolupament.<br/>La microscòpia confocal ens ha permès l'observació dels nuclis o nucleoides i els plans de divisió cel·lular en l'espai; la forma, l'organització i el gruix de les beines mucilaginoses que envolten els microorganismes fotosintètics, així com les substàncies polimèriques extracel·lulars presents al biofilm. Gràcies a l'autofluorescència dels pigments fotosintètics s'ha pogut reconèixer diferents caràcters com plans de divisió, distribució dels til·lacoids i/o de cloroplasts, localització de cèl·lules especialitzades o tipus de ramificació, per a la identificació i la caracterització dels cianobacteris i altres microorganismes fotosintètics. El processament de les seccions per obtenir els diferents tipus d'imatges tridimensionals va permetre caracteritzar l'estructura dels biofilms, mostrant la distribució espacial dels microorganismes, els EPS i el substrat, així com la disposició i la morfologia dels microorganismes en profunditat i la porositat d'aquestes comunitats.<br/>També es va elaborar un programa informàtic on es van implementar les diferents funcions de quantificació útils per a l'estudi d'aquestes comunitats: biovolum, distribució de biomassa, gruix mitjà, distribució del gruix, rugositat, porositat i distribució de la porositat, i cobertura de la superfície. <br/>Pel que fa a l'anàlisi dels pigments fotosintètics presents en cadascun dels microorganismes fototròfics, s'ha posat a punt un mètode per obtenir els espectres de fluorescència d'una àrea seleccionada de la mostra mitjançant el microscopi confocal espectral. Espècies pertanyents a diferents grups filogenètics, com <i>Cyanobacteria</i>, <i>Bacillariophyta</i> o <i>Chlorophyta</i>, van presentar unes característiques i unes propietats de fluorescència dels seus pigments característiques que en permetien la discriminació respecte d'altres grups filogenètics. Així mateix, amb aquesta tècnica es va poder determinar quines eren les espècies de cianobacteris amb ficoeritrina i sense.<br/>Posteriorment, s'han determinat els microorganismes fotosintètics més representatius de diferents tipus de cavitats naturals i catacumbes, així com la seva distribució i els factors ambientals a què estan sotmesos, en la natura i en cultiu. En els ambients hipogeus prospectats, la temperatura i la humitat eren relativament elevades i constants, mentre que la llum, tant la solar que entrava en coves i avencs, com l'artificial, per il·luminar coves turístiques o catacumbes, semblava el factor determinant de la presencia i la distribució dels microorganismes i dels biofilms que formaven. En les tres cavitats naturals estudiades al massís càrstic del Garraf (Barcelona, NE Espanya), la temperatura, la humitat relativa i la llum, presentaven clars gradients, des de l'entrada fins a una certa profunditat, on les condicions romanien constants. Els biofilms formats per cianobacteris cocals mucilaginosos i de color fosc es van tornar més prims amb la disminució de la llum i gradualment van ser substituïts per biofilms formats per cianobacteris filamentosos amb beines transparents calcificades, com <i>Geitleria calcarea</i> i <i>Loriella osteophila</i>, que produïen taques blanques a les parets. En general, a l'entrada de les cavitats es va observar la majoria d'espècies trobades pertanyents als grups <i>Chlorophyta</i> i <i>Bacillariophyta</i>. Els líquens crustacis de l'entrada de les cavitats van ser substituïts per altres de tal·lus leprós, com <i>Botryolepraria lesdainii</i> i <i>Macentina stigonemoides</i>. <br/>L'autofluorescència i el marcatge selectiu dels EPS han permès seguir la formació de les substàncies mucilaginoses que intervenen en els primers passos dels processos d'adhesió dels hormogonis. En alguns taxons de cianobacteris filamentosos, com <i>Leptolyngbya </i>spp. i <i>Scytonema </i>spp., els extrems polisacarídics dels hormogonis semblen actuar com a mecanismes d'adhesió, com una mena de goma d'enganxar al començament de l'adhesió al substrat. <br/>A les Catacumbes Romanes, els principals organismes formadors de biofilms van ser les molses i els cianobacteris filamentosos amb beina. L'estructura dels biofilms era heterogènia, especialment en gruix, densitat i composició d'organismes. De manera semblant al cas de les coves i els avencs, es va observar una diversitat decreixent en els biofilms fototròfics en disminuir la irradiància. Atès que la llum fou el factor més important que influïa en aquests biofilms i que el rang de longituds d'ona menys absorbit corresponia a la zona del verd (500-560 nm), es va avaluar el potencial de la llum verda per prevenir el creixement del biofilms fototròfics. Es va examinar el seu efecte en biofilms formats pel cianobacteri <i>Gloeothece membranacea</i> (Cyanobacteria) i l'alga verda <i>Chlorella sorokiniana</i> (Chlorophyta). La resposta dels biofilms a la llum verda va comprendre diferències en la fluorescència dels pigments, el gruix dels biofilms, així com la simplificació de la seva estructura tridimensional, si es compara amb els biofilms sota llum blanca. També es va estudiar l'efecte que produeix la llum verda en la morfologia i la ultraestructura de l'espècie aerofítica Gloeocapsopsis magma, aïllada de la cova turística de Collbató (Barcelona, NE Espanya). Les beines de les cèl·lules sota llum verda no eren estratificades i les cèl·lules van ser significativament més llargues que les cèl·lules sota llum blanca de la mateixa edat. Respecte de la ultraestructura, les cèl·lules en llum verda contenien només alguns tilacoides distribuïts a l'atzar, grànuls de cianoficina i polifosfats dispersos en el citoplasma. Per altra banda, es va estudiar in situ l'efecte que produïa la suma de factors: la presència de llum verda i l'aplicació dels biocides convencionals - dues formulacions de clorur de benzoalconi - utilitzats en les neteges de les obres d'art. Es va seleccionar com a zona d'estudi model la cova de Collbató (Barcelona, NE Espanya). Els resultats d'aquest estudi van demostrar que els biocides redueixen la biomasa, registrada d'acord amb els nivells de fluorescència comparats amb els dels controls. A més, sota llum verda i biocides, l'abundància de Scytonema julianum i altres espècies predominants va disminuir, excepte en els casos de <i>Nostoc punctiforme</i> i <i>Gloeocapsopsis magma</i>, ambdues cobertes amb beines de polisacaràrids molt gruixudes i amb un ampli ventall de pigments accessoris. Atès que la llum verda contribueix a alentir el creixement dels microorganismes fotosintètics i fa que penetrin menys a l'interior dels substrats; pot esdevenir una estratègia eficient per evitar el biodeteriorament de monuments hipogeus il·luminats artificialment, fins i tot en els dominats per cianobacteris rics en pigments accessoris, com la ficoeritrina.

<i>Caves with dim natural light, and lighted hypogean environments, have been found to host phototrophic microorganisms from various taxonomic groups. These microorganisms group themselves into assemblies known as communities or biofilms, which are associated with rock surfaces. In this work, the phototrophic biofilms that colonise speleothems, walls and floors in three tourist caves (Spain) and Roman hypogean monuments (the St. Callistus and St. Domitilla catacombs, Rome, Italy) were studied. <br/>Confocal laser scanning microscopy (CLSM) and scanning (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) were used to study these organisms and acquire three-dimensional data on their biofilm structure. CLSM was used in a multi-channel mode whereby the different channels map individual biofilm components. Photosynthetic organisms were visualized by their in vivo pigment fluorescence, whereas extracellular polymeric substances (EPS) and the DNA structures of photo- and heterotrophic microorganisms were determined by staining with Concanavalin-A (Con-A) conjugated to the fluorophore label Alexa Fluor 488 and with the fluorophore label Hoechst 33258, respectively. The reflection mode revealed calcified sheaths and inorganic substrata. The distribution of microorganisms and EPS in the biofilms, and the relationship between the biofilms and their substrata, were studied by image analysis. Cyanobacteria, green microalgae, diatoms, mosses and lichens were found to be grouped as biofilms that differed according to the sampling sites. A confocal technique for the analysis of fluorescent pigments from a single cell, based on spectrofluorometric methods is also reported. Analysis of fluorescent pigments allows the establishment of a simultaneous relationship among in vivo pigment identification, organism morphology and 3D localization of cells that have particular fluorescence signatures within the biofilms. Finally, an evaluation of the use of monochromatic green light (GL) illumination as a method for preventing biofilm growth was performed. The CSLM permitted a comparison of the effects of illuminating photosynthetic biofilms with GL and with white light (WL). The results show retarded biofilm growth in the case of the former, suggesting the utility of GL for the illumination of cultural patrimony sites that are threatened by photosynthetic biofilms. </I>