Caracterización funcional de un nuevo factor bHLH de Zea mays

Abstract

La sequía es el factor más limitante para el crecimiento de las plantas y el acido abscísico (ABA) es la principal fito-hormona involucrada en la respuesta al estrés hídrico. El núcleo de señalización está formado por: los receptores de ABA PYR/PYL/RCAR, las proteínas fosfatasas de tipo C grupo A (PP2Cs) y las proteínas quinasas de tipo SnRK2 /OST1. Trabajos realizados en nuestro laboratorio permitieron caracterizar una proteína quinasa SnRK2 en maíz, la ZmOST1, que complementa el mutante de pérdida de función de Arabidopsis (ost1-2) en la respuesta a sequía. Realizando un cribado de doble híbrido en levadura, en el que se utilizó ZmOST1 como anzuelo frente a una librería de cDNAs de hoja joven de maíz deshidratada, se identificó un factor de transcripción (TF) de tipo bHLH entre los posibles interactores de la quinasa. En este trabajo se detallan los resultados obtenidos en la caracterización molecular y funcional de este TF denominado ZmKS (kinase substrate) y las diferencias funcionales de sus dos isoformas que se han denominado ZmKS1 y ZmKS2. El estudio del patrón de transcripción muestra que ZmKS se expresa en hoja y raíz de maíz así como en embrión y radícula en plantas transgénicas de Arabidopsis portadoras del promotor ZmKS fusionado a GUS. El patrón de expresión de las dos isoformas indica que los niveles de transcritos de ZmKS2 son más elevados que los detectados para ZmKS1 y que responden de forma similar a distintos tratamientos de estrés: para ambos, con ABA la cantidad de RNA aumenta en hoja y también en raíz con NaCl. Hemos averiguado que ZmKS es una proteína nuclear capaz de homo- y hetero-dimerizár y que interacciona preferentemente con una secuencia de DNA E-box like de 7 bp, como corresponde a un factor de transcripción del tipo bHLH. ZmKS1 y ZmKS2 presentan residuos fosforilables por la quinasa OST1 que son específicos de cada isoforma y ambas son directamente fosforiladas por ZmOST1 in vivo e in vitro. Las dos isoformas interaccionan en planta con ZmOST1 a través del dominio osmótico y/o ABA de la kinasa, esta interacción es nuclear para ZmKS1 mientras para ZmKS2 se localiza en núcleo y citoplasma. Análisis funcionales han revelado que la sobre-expresión de ZmKS en Arabidopsis determina un retraso en la germinación que es dependiente de fosforilación y del tratamiento con ABA. Las plantas transgénicas de ambas isoformas presentan una mayor apertura estomática y una respuesta mayor a la fusicoccina. Sin embargo la regulación estomática en estas plantas no depende de fosforilación. Los ensayos de tolerancia a la desecación tanto en plantas transgénicas de maíz como de Arabidopsis sobre-expresando ZmKS2 presentan una tasa mayor de pérdida de agua: este efecto diferencial de las dos isoformas en las plantas transgénicas sugiere un importante papel regulador del gen ZmKS en la tolerancia a la desecación. ZmKS se autoregularía tanto por splicing diferencial alterando las cantidades relativas de cada isoforma ZmKS1y ZmKS2 como mediante la fosforilación/defosforilación de las mismas.

Drought is the most limiting factor for plant growth worldwide and abscisic acid (ABA) is the major phytohormone mediating drought responses in plants. SnRK2/OST1 proteins are plant specific kinases that together with the ABA ligands PYR/PYL/RCAR and the type 2C protein phosphatases constitute the central core of ABA perception and signal transduction.

Previous work in our group characterized the OST1 from Zea mays and established its role on ABA signaling. Previous work identified a bHLH transcription factor as a new ZmOST1 interactor. In the present work we have functionally characterized this bHLH, named ZmKS (kinase substrate) and its two isoforms, ZmKS1 and ZmKS2.

ZmKS is expressed in leaves and roots of maize, as well as in embryos and roots of Arabidopsis transgenic lines expressing GUS under the control of its promoter. The comparison between the expression levels of the two factor’s isoforms revealed that the ZmKS2’s transcript amount is higher than that of ZmKS1. However, they both respond similarly to different stress treatments such as ABA and NaCl .We established that ZmKS is a nuclear protein capable of homo- and hetero-dimerization and that it can bind to an E-box like nucleotide sequence of 7 bp. The two isoforms present common and specific amino acid residues that can be phosphorylated by the ZmOST1 and we figured out that they interact with and are substrate of ZmOST1 in vivo and in vitro.

Functional analysis revealed that in transgenic Arabidopsis plants over-expressing the two isoforms the germination process is delayed and that it is dependent on both phosphorylation and ABA treatment. These transgenic lines show an increased stomatal aperture not depending on the phosphorylation. During dehydration, transgenic lines of Arabidopsis and maize show that over-expression of ZmKS2 leads to an increase in water loss.

Our results established ZmKS as a novel cognate substrate of ZmOST1 and suggest that ZmKS could play an important role in regulating desiccation tolerance by two mechanisms: by differential splicing altering the relative amounts of each isoform and by phosphorylation/de-phosphorylation of ZmKS1 and ZmKS2 by ZmOST1, revealing a novel OST1/ZmKS regulatory pathway during osmotic stress signaling.