Síntesis d'anàlegs de BEL i de substrat com a nous potencials inhibidors de la fosfolipasa independent de calci(grup VIA)

Abstract

En els últims anys s'ha demostrat que els lípids no són només components estructurals de la membrana plasmàtica sinó que a més a més aquests desenvolupen diferents funcions cel·lulars. Concretament s'ha observat que els productes de degradació de les fosfolipases són importants en els processos d'inflamació, entre d'altres; i sembla ser que la fosfolipasa A2 independent de calci podria estar relacionada amb la esquizofrènia. La síntesis de nous potencials inhibidors d'aquesta proteïna per estudiar el metabolisme d'aquests lípids ha estat l'objectiu principal en el transcurs d'aquesta tesi doctoral.<br/>Per a dur a terme aquest treball, s'han sintetitzat diferents anàlegs a l'únic inhibidor selectiu d'aquest enzim (BEL), introduint diferents modificacions per intentar obtenir un inhibidor reversible igual de selectiu. Una d'aquestes modificacions va ser la introducció de la funcionalitat trifluorocetona, comú en diferents inhibidors de lipases, en l'esquelet de BEL. Desafortunadament, cap dels compostos sintetitzats sota aquest disseny no va presentar les propietats inhibitòries desitjades. Es va dissenyar una segona família de compostos introduint grups ariloxi- en la estructura de BEL; en aquest cas tampoc es van obtenir bons inhibidors, en canvi, dos d'aquests compostos van augmentar la activitat d'aquest enzim selectivament respecte a la fosfolipasa A2 dependent de calci (cPLA2).<br/>Una altra aproximació per dissenyar nous inhibidors va consistir en la síntesi d'anàlegs de substrat. Aquests compostos presentaven un grup n-hexadecilmercaptà a la posició sn-1 i el grup fosforilcolina a la posició sn-3 de l'esquelet de glicerol, amb diferents funcionalitat (amida, carbamat, sulfonamida...) i cadenes laterals diverses a la posició sn-2. Entre els diferents productes sintetitzats, alguns d'ells van presentar nivells d'inhibició destacables, no obstant quan es va estudiar la selectivitat sobre cPLA2 es va observar que també inhibien aquest enzim.<br/>Per tal de poder conèixer millor la estructura del centre actiu de l'enzim en estudi i poder dissenyar millors inhibidors es van clonar i expressar en bacteri dos fragments del centre catalític del enzim. Desafortunadament, aquests fragments s'expressaven en petites quantitats i s'agregaven en cossos d'inclusió i els diferents experiments que es van realitzar per resoldre aquests problemes no van conduir a resultats satisfactoris.<br/>Durant el transcurs de la tesi, es van preparar, també, diferents anàlegs de ceramida. Els assaigs preliminars d'aquests compostos en diferents enzims del metabolisme d'esfingolípids van mostrar que s'havia dissenyat i sintetitzat una nova família de compostos que obre una línia de recerca prometedora en el camp dels esfingolípids.

<I>In last decades, researchers have demonstrated that lipids are not only structural compounds of cellular membranes. These compounds have several functions in cell metabolism, specifically, phospholipids are cleaved by phospholipases, and their metabolites are secondary messengers in inflammation pathways. Moreover calcium-independent phospholipase A2 (iPLA2) might be linked to schizophrenia. Synthesis of new inhibitors of this enzyme has been the main aim of this work.<br/>In our group we have designed different analogues of the only inhibitor of this enzyme (BEL). We introduced several modifications and functional groups, like trifluoroketones, in BEL's structure. Unfortunately, any of these compounds could not inhibit the activity of the enzyme. Some compounds that have an ariloxigroup in alpha position of ketone increase activity of iPLA2 and not produce the same effect in cPLA2.<br/>Then, we have synthesized analogues of the natural substrate of phospholipases with several modifications; thioether group in sn-1 position, phosphorilcholine group in sn-3 position and different functional groups (amide, carbamate, sulfonamide.) in sn-2 position.<br/>Some of these compounds show inhibition of iPLA2, moreover, they also inhibit cPLA2.<br/>To know more information about catalytic mechanism of this phospholipase and design new inhibitors we have cloned and expressed two fragments of catalytic site of the enzyme. However these proteins are not soluble and its levels of expression were very small, and we could not do structural studies like X-ray crystallization.<br/>Furthermore, we have designed and synthesized analogues of ceramide. Biological assays of these compounds in several enzymes of sphingolipid metabolism proved that this family opens a new research line in sphingolipid field. </I>