Estudio teórico y experimental de cetoximas y aldononitrilos peracetilados

Abstract

El estudio de los azúcares libres, sea cual sea el método a utilizar, genera principalmente un problema que es la coexistencia en solución de más de una estructura (formas abiertas, cíclicas..) para la misma sustancia. Nuestra idea se basa en utilizar un único tipo de derivados versátiles, de los que sea factible extraer información por aplicación de todas las técnicas posibles. El presente estudio se ha realizado sobre los aldononitrilos peracetilados (PAAN), y las cetoxinas peracetiladas (PAKO) producidas simultáneamente en el mismo sistema de reacción y que conservan la total identidad de las aldosas y las cetonas de partida. Sobre estos derivados se ha llevado a cabo un estudio analítico por cromatografía de fases y cromatografía líquida de alta resolución, así como se ha desarrollado un método de identificación estructural de azúcares, específicamente de aldosas. En resumen, los resultados más relevantes obtenidos son:<br/><br/>1. Los aldononitrilos peracetilados (PAAN) y cetoxinas peracetiladas (PAKO) son derivados de los monosacáridos que desde todos los puntos de vista de su comportamiento cromatográfico, cromatografía de gases o cromatografía líquida, estabilidad, purificación, comportamiento en espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear y estudio conformacional teórico por aplicación de la Mecánica Molecular, han demostrado ser adecuados para el fin propuesto, es decir, disponer de un método de asignación estructural de azúcares. <br/><br/>2. Se ha completado lo descrito para la cromatográfia de gases-espectrometría de masas de los aldononitrilos peracetilados con su extensión a todos los derivados de monosacáridos de tres a seis átomos de carbono, y a la utilización de columnas capilares. Las cetoxinas peracetiladas se han estudiado en menor extensión debido a la no disponibilidad comercial de numerosas cetosas. Se han determinado condiciones cromatográficas que permiten la separación total de todos los compuestos estudiados. <br/><br/>3. El principal problema que presenta la cromatografía líquida de alta resolución en su aplicación a los derivados elegidos radica en las columnas disponibles en el mercado. Ninguna de ellas, de polaridad ordinaria, fase reversa, polaridades intermedias, aquirales o quirales, ha permitido una resolución aceptable para la totalidad de los productos estudiados. Sí se han logrado condiciones, en especial en columnas del tipo C-18, para separar de modo razonable mezclas de hasta siete compuestos distintos, lo que mejora la mayoría de los trabajos descritos hasta la fecha. <br/><br/>4. Los azúcares sin previa derivación presentan grandes problemas a la hora de su estudio cromatográfico por cromatografía líquida de alta resolución, hasta el punto de que, entre las columnas ensayadas por nosotros, incluso la más específica teóricamente diseñada para este tipo de análisis (columna de intercambio catiónico), es incapaz de resolver mezclas sencillas de monosacáridos. <br/><br/>5. Se ha preparado una nueva fase estacionaria quiral por anclaje del aminoácido L-treonina a una aminosílice, aplicando los métodos propios de la síntesis de péptidos en fase sólida. Esta preparación ha presentado dificultades suplementarias debido a la restricción del rango de pH que plantea el soporte sólido utilizado. La fase estacionaria así preparada ha presentado un comportamiento cromatográfico análogo a los aminosílices convencionales, sin mejorar la resolución de la separación de los aldonomitrilos y cetoxinas peracetiladas, ni ha resultado útil en la resolución de las mezclas racémicas ensayadas. <br/><br/>6. Se han registrado, interpretado y determinado las constantes de acoplamiento de diecinueve diferentes aldonomitrilos y cetoxinas peracetiladas.<br/><br/>7. Se ha ampliado el campo de aplicación del programa de Mecánica Molecular (MM2) por parametrización de las constantes necesarias relativas a la presencia de un grupo ciano con un grupo acetoxi. Para esta parametrización se han empleado los datos estructurales y conformacionales de ventiuna moléculas, así como se han calculado por MNDO datos análogos para otras once moléculas cuyos valores no se encontraban en la literatura. <br/><br/>8. Los datos de las constantes anteriormente citadas se han empleado, junto con las ya incluidas en el programa MM2, para la determinación de las poblaciones conformacionales relativas de treinta aldononitrilos peracetilados, que abarcan desde los derivados de las aldotetrosas a los de la aldoheptosas, inclusive. Los datos obtenidos han servido, además, para el análisis conformacional de estos compuestos. <br/><br/>9. A partir de los datos conformacionales anteriores se ha aplicado la ecuación de Altona para predecir las constantes de acoplamiento vecinales de estos sistemas. Dado que la concordancia hallada era limitada, se ha reparametrizado dicha ecuación por aplicación del programa KEONE, obteniéndose a partir de estos nuevos parámetros una concordancia del 100% entre los valores teóricos y los experimentales de acuerdo con el criterio de desviación estándar "r.m.s".<br/><br/>10. Por último, como resultado del presente trabajo se dispone de un método de determinación estructural de aldosas, tal que por formación de sus aldononitrilos peracetilados, estudio cromatográfico por cromatografía de gases y cromatografía líquida de alta resolución, espectrometría de masas, determinación de las constantes de acoplamiento vecinales y correlación de estas constantes con las calculadas teóricamente por aplicación de la Mecánica Molecular y la ecuación de Altona reparametizada, se está en condiciones de reconocer la aldosa de partida. Este método se ha puesto a punto con las aldosas de cuatro a seis átomos de carbono y es de aplicación práctica para aldosas de mayor tamaño.

In the present dissertation, the paracetylated hetooxines and aidononitriles are proposed as adequate derivatives to analyse sugar mixtures. They are stable and easy made derivatives that conserve all the structural features of the parent sugar. There are two main parts in the dissertation. The first one is referred to the analysis of sugar mixtures by using chromatographic methods as gas chromatography and high performance liquid chromatography. Good resolutions are obtained using capillary columns (SE-54) for gas chromatography. This technique has been employed coupled with mass spectrometry, which gives quickly information about the nature of the sugar (aldose or ketose) and the length of the hydrocarbon chain. Several columns have been studied as stationary phases for the separation of this kind of compounds by HPLC. Better resolutions are obtained with reverse phases. A new chiral stationary phase for HPLC has been syntetized anchoring the aminoacid threonine to an aminophase. This synthesis has been done following the methodology of synthesis of peptides in solid phase. The second part is related with the structural study of these compounds creating a correlation between experimental coupling constants between vicinal hydrogens, calculated ones and configuration. Firstly, coupling constants of peracetylated aldononitriles of four, five, six carbon atoms in the hydrocarbon chain, as well those of the D-glycero-D-gulo-hetpononitrile, have been determinated. Secondly, theoretical coupling constants have been calculated applying the Altona' equiation to the different confirmations estimated for each compound. Previously, a conformational analysis has been done using the Molecular Mechanics approach (MM2). It was necessary to parametrize this program previously to its use. Now the force field of MM2 has been enlarged, being possible to calculate structures and conformational energy differences of cyano compunds with ester groups in positions. Finally, the comparison of the experimental data, H,H vicinal coupling constants, with the calculated one has proved this is a good method for total identification of aldoses.