Dynamic Multivalency For The Recognition Of Protein Surfaces

Abstract

En esta tesis doctoral el concepto de multivalencia en el reconocimiento de proteínas (lectinas) con azúcares se combinó con la idea de la química dinámica combinatoria. Esto se aplicó, no sólo para sacar ventaja del efecto de la mejor afinidad de tales sistemas multivalentes, sino también para dotar al sistema con una mayor variedad de constituciones y geometrías. La determinación de las afinidades relativas de los miembros de la biblioteca dinámica dio una visión de los requisitos necesarios para la unión entre azúcares – lectina. El primer enfoque para acceder a los sistemas multivalentes para el reconocimiento de lectinas (presentado en el capítulo 2 de la tesis), está basado en estrategias bien conocidas. Enlaces covalentes reversibles son usados para acceder a bibliotecas dinámicas combinatorias (DCLs). En esta parte del trabajo se confirmó la viabilidad del procedimiento analítico elegido. Especies diméricas, similares a las que se había conocido desde experimentos de otros grupos, mostraban buena analisabilidad de los DCLs formados. El método analítico elegido (HPLC MS) permitió la detección de las afinidades y selectividades relativas de tales constituyentes de la respectiva biblioteca. Para la elaboración de las bibliotecas dinámicas, varios intentos fueron realizados basados en el mismo concepto: Una subunidad central con múltiples puntos de conexión para favorecer interacciones reversibles.

Formación de una librería dinámica basada en un conector central. Específicamente, se evaluaron los puentes di sulfuro y la formación de imina. Algunos de estos estudios resultaron ser complicados por problemas secundarios, tales como solubilidad en agua y las interacciones secundarias no deseadas de unidades centrales, debido principalmente a reacciones intramoleculares. Sin embargo, finalmente se obtuvo una biblioteca combinatoria dinámica multivalente y se analizó con éxito mediante técnicas de HPLC-MS. El DCL, está basado en el intercambio de sulfuro para formar puentes di-sulfuro entre las diferentes unidades de azúcar. Esto fue posible gracias a la solubilidad en agua de las subunidades carboxilato y al uso de enlaces cortos entre los puntos de conexión del tiol y de la estructura central, evitándose la formación de enlaces intramoleculares.

Formación de una librería dinámica. Las partes se conectan a través de enlaces disulfuros. Sin embargo, incluso cuando se controlaron los problemas mencionados anteriormente, la formación fiable y estable de los miembros de la librería era difícil debido a la desintegración sustancial durante la etapa de análisis. Por lo tanto, la posterior comparación de las afinidades de los miembros de la DCL no era posible. No obstante, los enfoques presentados ofrecen oportunidades para nuevos experimentos, que con una cuidadosa elección de las condiciones pueden conducir al éxito. Desafortunadamente, el marco temporal de esta tesis no lo permitió estudiar en detalle; había que seguir otras pistas más prometedoras. La coordinación de ligando metal, especialmente con ligandos de tipo bipiridina coordinados a centros de FeII, evitó la mayoría de problemas encontrados anteriormente (parte desarrollada en el Capítulo 3). Observándose que en las condiciones necesarias para trabajar con la proteína elegida (ConA lectina) la formación de complejos era muy fiable. Como primera prueba de concepto para un comportamiento de dinámica combinatoria, se evaluaron DCLs simples que no contenían azúcares sobre la base coordinativa bipyridina.

Una librería dinámica basada en el intercambio de ligandos de un centro metálico. Después, DCLs que contenían azúcares fueron sintetizadas y fueron comprobadas con la proteína. Ligandos con sustituyentes azúcar fueron usados como bloques prefabricados, obteniéndose, mediante síntesis sencillas y con buenos rendimientos.

Ligandos con sustituyentes azúcares y basados en bipyridina que pueden formar complejos hexavalentes. Métodos de HPLC bien elegidos permitieron el análisis de los DCLs, así como la determinación de las afinidades relativas con la lectina ConA. La cuantificación de las entidades con más afinidad apoyó el concepto de multivalencia para sistemas que intercambian dinámicamente múltiples unidades de reconocimiento. A partir de este estudio básico, se desarrollaron otras DCLs que incorporaron componentes de diferentes geometrías. Las afinidades relativas de estos complejos compararon y revelaron que algunos miembros de la biblioteca contienen disposiciones tridimensionales más afines para la interacción con la lectina.

La proteína tiene más afinidad a un único miembro de la biblioteca dinámica Por otra parte, los miembros de la librería de forma esférica parecen mostrar mayor afinidad a la proteína, en acuerdo con la teoría de “statistical rebinding”.

Una biblioteca dinámica de geometrías diferentes. En resumen, DCLs basadas en la coordinación con metal (en contraste con enlaces covalentes dinámicos) han demostrado que constituyen una manera fácil de acceder a los procesos de intercambio multivalentes, proporcionando nuevas perspectivas para desentrañar las reglas de interacciones multivalentes de azúcares - lectina.