Estratègies terapèutiques per la Neurofibromatosi de tipus 1

Abstract

A la primera part d’aquesta tesi es van analitzar les bases genètiques i moleculars responsables d’un fenotip lleu observat en una pacient NF1. La pacient és portadora d’una mutació puntual de novo en el gen NF1 (c.3198-314G>A). Aquesta mutació es troba a l’intró 19a i provoca la creació d’un nou lloc acceptor d’splicing. Aquest utilitza dos llocs donadors críptics diferents preexistents a l’intró 19a (inactius quan no es troba la mutació) per generar dos transcrits aberrants diferents, cadascú dels quals presenten la inclusió d’un exó críptic diferent. Ambdós trànscrits aberrants codifiquen per a una proteïna truncada.

La quantificació de les cèl•lules portadores de la mutació en diferents mostres derivades de les tres capes embrionàries van evidenciar que es tractava d’un cas de mosaicïsme generalitzat. A més a més, l’anàlisi de la inacitvació del cromosoma X en els mateixos teixits derivats de les tres capes embrionàries van suggerir un avantatge proliferatiu de les cèl•lules portadores de la mutació en el gen NF1.

D’altra banda, l’anàlisi dels nivells de transcrits aberrant en teixits frescos i cultius curts de limfòcits i fibroblasts, així com la construcció d’un minigen amb la mutació del pacient (c.3198-314G>A), van confirmar una baixa expressió dels transcrits amb inclusió d’exó críptic, a causa de la generació de trànscrits normals per part de l’al•lel portador de la mutació. En conjunt es va concloure que la clínica lleu del pacient podia ser explicada per una combinació de mosaïcisme genètic i per la producció de trànscrits normals per part de l'al•lel mutat.

Finalment, es va desenvolupar una teràpia personalitzada per a corregir aquesta mutació, i es va demostrar la correcció de l’splicing aberrant gràcies a la utilització de oligòmers mofolino antisentit específics contra els llocs críptics d’splicing (el generat per la mutació i els dos activats per la presència de la mutació).

A la segona part de la tesis es van generar 5 models de ratolins xenògrafts ortotòpics derivats de 2 pacients NF1 (n=2), 2 casos esporàdics (n=2) i d’una línia cel•lular establerta a partir d'un tumor d'un pacient NF1 (línia S462). Els models ortotòpics generats van estar caracteritzats a diferents nivells, demostrant que recapitulaven les propietats histopatològiques i preservaven l’estat genòmic i transcriptòmic dels seus respectius tumors primaris. A més a més, es va veure, que els models de ratolí generats mimetizaven les capacitats metastàsiques observades en humans. D’altra banda, també es va demostrar, que l’estroma humà es reemplaçava ràpidament per estroma de ratolí després de la implantació dels tumors, la qual cosa va demostrar ésser molt útil per a la caracterització genòmica dels tumors.

Els resultats obtinguts en la caracterització genòmica mitjançant l’SNP array, van mostrar com els MPNST contenien uns genomes molt alterats, que majoritàriament es mantenien estables un cop implantats al llarg dels diferents passatges en el model. L’anàlisi d’expressió va agrupar cada un dels tumors primaris amb els seus respectius ortoxenògrafts i també va diferenciar de forma molt clara els tumors esporàdics dels associats a la NF1. Els resultats obtinguts de la seqüenciació de l’exoma, van mostrar per un costat, que el nombre de mutacions adquirides en els tumors un cop implantats en el ratolí, era molt baixa en tots els models. D'altra banda els resultats van evidenciar que la freqüència de mutacions en els MPNST esporàdics era un ordre de magnitud més elevada que en els derivats de pacients NF1, amb una representació més alta de substitucions de bases C>T en els esporàdics.

Finalment, els 5 models ortoxenògrafts validats, van ser utilitzats per provar l’eficàcia de diferents fàrmacs de manera sola i combinada. Aquests fàrmacs van ser el sorafenib (inhibidor de BRAF), la rapamicina (inhibidor de mTOR) i la doxorubicina (agent quimioterapèutic convencional). Els resultats més prometedors van mostrar que el tractament amb sorafenib s’associa a una major reducció del creixement tumoral, tant quan s’administra sol com en combinació amb els altres dos fàrmacs. Així mateix, l'administració intraperitoneal de la rapamicina va causar una reducció tumoral significativa en tots els models.

D’altra banda també es va realitzar el tractament de dos models xenògrafs ortotòpics derivats de tumors MPNST primaris humans (un esporàdic i un de pacient afectat amb NF1) amb MLN8237 (inhibidor de aurora cinasa A).Els resultats per aquest fàrmac, van mostrar una estabilització del creixement tumoral, causant la parada del cicle cel•lular i una endoreduplicació de les cèl•lules tumorals.

In the present tesis we analyze the genetic and molecular basis responsible for a very benign phenotype observed in a NF1 patient. Quantification of cells carrying the NF1 mutation in different samples derived from the three embryonic layers revealed a generalized mosaicism that appeared to be more complex after obtaining evidence of proliferation advantages of mutated cells. Furthermore, the construction of a minigene reporter carrying the patient’s identified deep intronic mutation (g.3198-314G>A) confirmed the benign nature of this mutation due to the leakiness of the splicing mechanism that generated a proportion of correctly spliced transcripts. On the light of these data we concluded that the mild phenotype observed in this patient is the result of the presence of a complex mosaicism together with the benign nature of a leaky NF1-splice mutation. Finally, with the aim of developing a personalized therapeutic approach for this patient, we demonstrated correction of the splicing defect by using specific antisense morpholino oligomers. Our results provide an example of the molecular complexity behind disease phenotypes and highlight the importance of using comprehensive genetic approaches to better assess phenotype-genotype correlations.

In the other hand we present the generation of five patient-derived MPNST orthoxenograft models for pre-clinical testing. MPNST orthoxenografts recapitulate the histopathological properties and preserve the genomic and transcriptomic status of their parental primary tumors, mimicking distal dissemination properties. MPNSTs contained highly altered genomes that remained remarkably stable in orthoxenografts and along passages. Although preliminary, the results presented here point to clear differences between NF1-associated and sporadic MPNSTs. In accordance, mutation frequency in sporadic MPNSTs was an order of magnitude higher than in NF1-associated MPNSTs and unsupervised cluster analysis and principal component analysis using a MPNST signature perfectly divided the samples between NF1 and sporadic MPNST. Finally, sorafenib in combination with doxorubicin or rapamycin, was found to be the most effective treatment for reducing MPNST growth. The development of these models laid the foundations for evaluating novel therapeutic strategies in the clinical setting.