Genotipado de las especies de Leishmania y variabilidad intraespecífica de L. infantum. Aportaciones al diagnóstico molecular y a la epidemiología de las leishmaniosis

Abstract

Los trabajos presentados en esta tesis doctoral se han basado en el uso, diseño y optimización de herramientas moleculares para facilitar el diagnóstico de las leishmaniosis humanas y de reservorios animales, así como para favorecer el conocimiento del agente causal a nivel interespecífico e intraespecífico.

Para el tipado interespecífico de Leishmania spp se ha optimizado un método basado en la lectura del tamaño de fragmentos marcados con fluorescencia, metodología denominada PCR-FFL (PCR-Fluorescent Fragment Length analysis). No sólo se han buscado mejoras en la técnica analítica, sino también en la sensibilidad evaluando la capacidad discriminatoria de la PCR-FFL sobre dos dianas distintas, las secuencias ribosómicas ITS-1 y 7SL, obteniéndose mejores resultados en cuanto a sensibilidad sobre 7SL. La comparación con la metodología clásica de PCR-RFLP nos ha permitido observar que a nivel metodológico la PCR-FFL presenta ventajas importantes, como la simplicidad y exactitud en la lectura de los resultados, gracias a la automatización del análisis. El uso de la PCR-FFL con ambas dianas sobre biopsia de piel o bien utilizando papeles de filtro representa una buena metodología para el diagnóstico y tipado interespecífico por su especificidad, exactitud, objetividad, elevada sensibilidad y rapidez en la obtención de los resultados.

La aplicación de metodologías moleculares en estudios epidemiológicos se ha dirigido a la detección de Leishmania en dos especies de erizos presentes en la zona de alta endemia de M’sila (Argelia): Atelerix algirus y Paraechinus aethiopicus, con el objetivo de determinar su papel como posibles nuevos reservorios del parásito. El estudio serológico ha revelado contacto pasado o reciente con el parásito. La posterior detección de ADN de Leishmania en estos animales mediante una qPCR de género de alta sensibilidad nos ha permitido confirmar la infección activa de los erizos en el momento del estudio. El genotipado de Leishmania sobre muestra se ha determinado mediante PCR-FFL, permitiendo identificar la especie L. major en una muestra de piel de los erizos estudiados. Para aumentar la sensibilidad del análisis, se ha realizado una doble amplificación mediante nested-PCR que ha permitido la identificación de L. major en todas las muestras restantes. Estos resultados han señalado por primera vez la existencia de L. major en erizos, y el papel de éstos como posibles reservorios de esta especie en el área estudiada.

El tercer objetivo de nuestro estudio ha consistido en analizar la diversidad intraespecífica de Leishmania infantum en sucesivos aislados del parásito obtenidos de pacientes co-infectados con Leishmania/VIH que presentan recaídas clínicas después del tratamiento, mediante el análisis de 20 microsatélites considerados polimorfos para L. infantum. El análisis de 25 aislados ha permitido detectar 18 genotipos distintos, indicando una gran diversidad a pesar de proceder de 8 pacientes co-infectados del área metropolitana de Barcelona. El bajo número de genotipos repetidos detectado ha indicado una baja proporción de recaídas clínicas entre los pacientes, no siendo las reinfecciones la única hipótesis, sino considerando otras posibilidades sobre el comportamiento del parásito en el hombre y la posible selección en los cultivos de laboratorio. En algunos casos, el análisis filogenético ha señalado una distancia genética próxima entre los aislados de un mismo paciente, que puede ser relacionado con mutaciones del parásito. La posibilidad de la infección mediante el uso de jeringas contaminadas ha sido considerada otra posible fuente de transmisión.

The work presented in this thesis is based on the design, use and optimization of molecular tools to improve the diagnosis of human leishmaniasis and the reservoir hosts, as well as to promote knowledge of the causal agent at interspecific and intraspecific levels.

The optimization of interspecific typing of Leishmania spp is based on a fluorescent fragment length analysis methodology called PCR-FFL. The sensitivity of the technique was evaluated on two different targets, the ITS-1 and 7SL sequences, with high sensitivity observed in both sequences, particularly 7SL. Compared with PCR-RFLP methodology, the automated PCR-FFL analysis proved simpler and allowed more accurate readings of the results. The use of PCR-FFL with both targets on skin biopsies or filter papers is a good methodology for interspecific typing of Leishmania.

Molecular techniques are usually applied for epidemiological purposes to identify new reservoir hosts. Our study is based on the detection of Leishmania in two hedgehog species of the highly endemic area of M'sila (Algeria), in order to determine their role as potential new reservoir hosts of the parasite. A serological study revealed contact with the parasite, and detection of Leishmania DNA by qPCR allowed us to confirm active infection. Genotyping of Leishmania was determined by PCR-FFL, and the species L. major was identified in one skin sample. A nested-PCR allowed the identification of L. major in all remaining samples. These results have revealed, for the first time, the existence of L. major in hedgehogs, and their role as potential reservoirs of this species.

Molecular techniques were also used for the intraspecific analysis of Leishmania infantum in 25 successive isolates from 8 co-infected Leishmania/HIV patients with clinical relapses after treatment. The analysis of 20 polymorphic microsatellites for L. infantum indicated high genotype diversity with 18 genotypes, only 3 of which were repeated. Clustering and phylogenetic analysis allowed the evolution of the infection to be studied, revealing cases of confirmed relapse, parasite evolution in the patients, mixed infections followed by differential selection by the parasite culture, and reinfection.