Structure-function study on Rpn10 monoubiquitination

Abstract

L’homeòstasi cel·lular depèn, en part, de la proteòlisi regulada pel sistema Ubicuitina-Proteasoma (UPS). Aquesta proteòlisi inclou la degradació de les proteïnes defectuoses o innecessàries per la cèl·lula i consta de dues etapes. En un primer pas, molècules d’ubicuitina s’uneixen covalentment a un grup amino (ε-NH2) d’alguna lisina del substrat diana. Aquest procés depèn de l’activitat enzimàtica de tres enzims, E1, E2 i E3. Tot seguit, el proteasoma s’encarrega de la seva degradació. El proteasoma és un complex multiproteic en forma de túnel de 2,5 MDa present en el nucli i el citoplasma de totes les cèl∙lules eucariotes i Archaebacteria. La senyal típica de degradació és una cadena d’ubicuitines que es forma a través d’enllaços isopeptídics entre la glicina G76 a la part C-terminal de la molècula i la lisina K48 de la següent ubicuitina.

Avui dia, s’han descrit tres receptors proteasomals de substrats poliubicuitinats, Rpn10, Rpn13 i Rpn15. La subunitat Rpn10 (Rpn10 en llevat de gemmació i S5a en humans), que també es troba en fraccions citosòliques, s’uneix a les cadenes de poliubicuitina mitjançant el domini UIM (Ubiquitin-interacting motif). Aquest domini és essencial per l’ubicuitinació del propi receptor. Els enzims involucrats en tal modificació són Uba1 (E1), Ubc4 (E2) i Rsp5 (E3). La poliubicuitinació de Rpn10 depèn de la participació d’una quarta ubicuitina lligasa, Hul5, i comporta la seva degradació proteasomal. Alhora, s’ha vist que una fracció de Rpn10 està conjugada a una sola molècula d’ubicuitina. Aquest tipus de modificació post-traduccional s’anomena monoubicuitinació. Quan Rpn10 està monoubicuitinat, deixa d’interaccionar amb substrats poliubicuitinats, afectant l’activitat proteolítica del proteasoma. Desxifrar els mecanismes pels quals Rpn10 es monoubicuitina ha estat l’objectiu d’aquesta tesi. La hipòtesi inicial és que la proteïna monoubicuitinada pateix un plegament provocat per l’interacció entre l’ubicuitina unida a Rpn10 i l’UIM. Aquest plegament bloquejaria l’UIM i no permetria l’addició de noves ubicuitines per part de la lligasa Rsp5. Per intentar validar la hipòtesi, hem començat optimitzant la reacció de monoubicuitinació de Rpn10 in vitro i hem trobat la seqüència mínima indispensable per obtenir tal monoubicuitinació. Hem observat que la meitat N-terminal de Rsp5, és dispensable per l’ubicuitinació de Rpn10 i hem vist que l’augment de la monoubicuitinació de Rpn10 causa un defecte en el creixement de les cèl·lules. Finalment, hem aconseguit poliubicuitinar Rpn10 in vitro, sense la participació de Hul5, mitjançant una mutació en bloc de la seqüència precedent l’UIM. Hem vist que aquesta seqüència està intrínsecament desestructurada i que la seva flexibilitat podria ser la raó per la qual l’UIM quedés inaccessible quan Rpn10 està monoubicuitinat.

Un coneixement en profunditat del sistema ubicuitina-proteasoma és fonamental per trobar la cura de les patologies humanes derivades de seu mal funcionament. La feina que fem al nostre laboratori és la base per a que en un futur malalties que semblen estar relacionades amb l’UPS -malalties autoinmunes, neurològiques, càncer, cardiopaties...- tinguin un millor tractament.

La homeostasis celular depende, en parte, de la proteólisis regulada por el sistema Ubicuitina-Proteasoma (UPS). Esta proteólisis incluye la degradación de las proteínas defectuosas o innecesarias para la célula y consta de dos etapas. En un primer paso, moléculas de ubicuitina se unen covalentemente al grupo amino (ε-NH2) de alguna lisina del sustrato diana. Este proceso depende de la actividad enzimática de tres enzimas, E1, E2 y E3. Acto seguido, el proteasoma se encarga de su degradación. El proteasoma es un complejo multiproteico en forma de túnel de 2,5 MDa presente en el núcleo y el citoplasma de todas las células eucariotas y Archaebacteria. La señal típica de degradación es una cadena de ubicuitinas que se forma a través de enlaces isopeptídicos entre la glicina G76 en la parte C-terminal de la molécula y la lisina K48 de la siguiente ubicuitina.

Hoy día, se han descrito tres receptores proteasomales de sustratos poliubicuitinados, Rpn10, Rpn13 y Rpn15. La subunidad Rpn10 (Rpn10 en levadura de gemación y S5a en humanos), que también se encuentra en las fracciones citosólicas, se une a las cadenas de poliubicuitina mediante el dominio UIM (Ubiquitin-interacting motif). Este dominio es esencial para la ubicuitinación del propio receptor. Las enzimas involucradas en tal modificación son Uba1 (E1), Ubc4 (E2) y Rsp5 (E3). La poliubicuitinación de Rpn10 depende de la participación de una cuarta ubicuitina ligasa, Hul5, y conlleva su degradación proteasomal. Asimismo, se ha visto que una fracción de Rpn10 está conjugada a una única molécula de ubicuitina. Este tipo de modificación post-traduccional se llama monoubicuitinación. Cuando Rpn10 está monoubicuitinada, deja de interaccionar con sustratos poliubicuitinados, afectando la actividad proteolítica del proteasoma. Descifrar los mecanismos por los cuales Rpn10 se monoubicuitina ha sido el objetivo de esta tesis. La hipótesis inicial es que la proteína monoubicuitinada sufre un plegamiento provocado por la interacción entre la ubicuitina unida a Rpn10 y el UIM. Este plegamiento bloquearía el UIM y no permitiría la adición de nuevas ubicuitinas por parte de la ligasa Rsp5. Para intentar validar la hipótesis, hemos empezado optimizando la reacción de monoubicuitinación de Rpn10 in vitro y hemos encontrado la secuencia mínima indispensable para obtener tal monoubicuitinación. Hemos observado que la mitad N-terminal de Rsp5 es dispensable para la ubicuitinación de Rpn10 y hemos visto que el aumento de la monoubicuitinación de Rpn10 causa un defecto en el crecimiento de las células. Finalmente, hemos conseguido poliubicuitinar Rpn10 in vitro, sin la participación de Hul5, mediante una mutación en bloc de la secuencia que precede al UIM. Hemos visto que esta secuencia está intrínsecamente desestructurada y que su flexibilidad podría ser la razón por la que el UIM quedaría inaccesible cuando Rpn10 está monoubicuitinada.

Un conocimiento en profundidad del sistema ubicuitina-proteasoma es fundamental para encontrar la cura de las patologías humanas derivadas de su mal funcionamiento. El trabajo que hacemos en nuestro laboratorio es la base para que en un futuro enfermedades que parecen estar relacionadas con el UPS -enfermedades autoinmunes, neurológicas, cáncer, cardiopatías...- tengan un mejor tratamiento.

Cellular homeostasis depends, partially, on the proteolysis regulated by the Ubiquitin-Proteasome System (UPS). This proteolysis includes the degradation of misfolded, damaged or unnecessary proteins for the cell and comprises two phases. In the first stage, molecules of Ubiquitin are attached covalently to a target substrate at the amide group (ε-NH2) of some lysine residues. This process depends on the enzymatic activity of three enzymes, E1, E2 and E3. Afterwards, the proteasome takes care of the degradation of the substrate. The proteasome is a barrel-shaped multiprotein complex of 2,5 MDa present in the nucleus and cytosol of eukaryotic and Archaebacteria cells. The canonical degradation signal is a chain of ubiquitins, which is built via isopeptide bonds between the glycine G76 at the C-terminus of the molecule and lysine K48 of the next Ubiquitin.

So far, three Ubiquitin proteasomal receptors, Rpn10, Rpn13 and Rpn15, have been described. The Rpn10 subunit that can also be found in an extraproteasomal pool, binds Ubiquitin chains by means of the Ubiquitin-binding motif (UIM). This domain is also essential for the ubiquitination of Rpn10 itself. The enzymes involved in this modification are Uba1 (E1), Ubc4 (E2) and Rsp5 (E3). Rpn10 polyubiquitination requires an additional Ubiquitin ligase, Hul5, and promotes Rpn10 degradation. However, a fraction of Rpn10 has been shown to be conjugated to only one Ubiquitin molecule, a type of post-translational modification that is called monoubiquitination. When Rpn10 is monoubiquitinated, its capacity to bind polyubiquitinated substrates is impaired, affecting the catalytic activity of the proteasome. The goal of this thesis is to decipher the mechanisms by which Rpn10 is monoubiquitinated. The initial hypothesis was that the monoubiquitinated protein undergoes a change in its conformation caused by the interaction between the Ubiquitin bound to Rpn10 and the UIM. This change would block the UIM and would not allow the conjugation of new ubiquitins by the ligase Rsp5. To validate the hypothesis, we started by optimizing the reaction of monoubiquitination of Rpn10 in vitro and we have determined the minimal sequence of Rpn10 required for this ubiquitination. We have shown that the N-terminus of Rsp5 is not essential for Rpn10 ubiquitination and observed that an increase in the levels of monoubiquitinated Rpn10 causes a slow-growth defect. Finally, we have been able to polyubiquitinate Rpn10 in vitro, independently of Hul5, via a mutation en bloc of the sequence that precedes the UIM. We have seen that this sequence is intrinsically unstructured and that its flexibility could be the reason why the UIM could be blocked when Rpn10 is monoubiquitinated.

A detailed knowledge of the Ubiquitin-Proteasome System is essential to find the cure for the pathologies that derive from its malfunction. The work we do in our lab is the base for that, in a future, diseases that seem to be related to the UPS -autoimmune, heart or neurological diseases, cancer,…- have a better treatment.