Estrategias Analíticas basadas en el Diseño de Inmunoreactivos de Clase para el Control de Residuos de Quinolonas en Leche

Abstract

La presencia de contaminantes y residuos químicos en los alimentos es un problema que actualmente genera gran preocupación, ya que presenta importantes implicaciones para la salud y la seguridad pública. En este sentido, el uso indiscriminado, inadecuado y/o fraudulento de fármacos veterinarios puede dar lugar a la presencia de residuos de los mismos en los alimentos de origen animal, entrando de esta forma en la cadena trófica y ocasionando riesgos para la salud. Por otro lado, este tipo de residuos puede ser liberado al medioambiente directamente o indirectamente a través de la utilización del estiércol procedente de animales tratados, generando de esta manera la contaminación de suelos y aguas. En el caso de los antibióticos, la presencia de cantidades residuales en alimentos y en el medioambiente ha sido identificada como una de las causas de la aparición de mecanismos de resistencia a los antimicrobianos por parte de patógenos que causan enfermedades humanas, lo que es motivo de gran preocupación por parte de las autoridades sanitarias, diferentes agencias y organizaciones gubernamentales y de la sociedad en general. Por lo tanto, existe la necesidad de garantizar la seguridad y la calidad de los productos alimenticios, tal es así que los consumidores son cada vez más exigentes, obligando a la industria alimenticia a tener en cuenta sus preocupaciones, en términos de una producción de alimentos más naturales, ecológicos y saludables con un origen claramente rastreable de todos sus ingredientes.

En esta tesis se describe la investigación realizada respecto al desarrollo de técnicas de análisis alternativas que permitan incrementar la eficiencia del control de residuos de antibióticos en alimentos, en base a la utilización de receptores selectivos (anticuerpos). Concretamente, el objetivo final de esta tesis se enfocó al desarrollo de técnicas inmunoquímicas e inmunosensores para la detección de residuos de antibióticos de tipo quinolona en leche. En este sentido, la producción de anticuerpos con selectividad de clase para quinolonas, una de las familias de antibióticos más importante en el ámbito veterinario, ha sido uno de los objetivos principales de este trabajo de investigación. De esta manera, se ha abordado la producción de dichos anticuerpos mediante el diseño racional y síntesis de los haptenos apropiados, utilizando el criterio químico y herramientas de modelización molecular. La evaluación de las características de los anticuerpos generados se ha realizado a través del desarrollo de ensayos de tipo ELISA en microplaca. Los resultados muestran que ha sido posible obtener anticuerpos de clase selectivos para quinolonas, ya que pueden ser detectados hasta diez congéneres de dicha familia con una detectabilidad adecuada para los requerimientos de la Comisión Europea. A su vez, se han desarrollado los protocolos necesarios para la aplicación de estos procedimientos inmunoquímicos al análisis de muestras de leche, estableciéndose un formato semicuantitativo capaz de identificar claramente las muestras libres de quinolona de las contaminadas. Asimismo, los inmunoreactivos y procedimientos inmunoquímicos establecidos se han implementado en un dispositivo inmunosensor amperométrico, basado en la utilización de partículas magnéticas. En este caso, a pesar de la complejidad de la leche, el uso de partículas magnéticas ha permitido la eliminación de las posibles interferencias causadas por los componentes de la matriz, pudiéndose realizar mediciones cuantitativas directamente en muestras de leche, sin ningún tratamiento de muestra adicional o etapa de extracción. Dicho inmunosensor es capaz de detectar hasta siete quinolonas diferentes por debajo de los límites máximos de residuos (LMRs) definidos por el Comisión Europea para la leche, ofreciendo una estrategia prometedora para el análisis in situ, rápido, simple y de bajo costo, de antibióticos de tipo quinolona en muestras complejas.

In this thesis, research on the development of alternative analysis techniques increasing the efficiency of the control of antibiotic residues in food is described based on the use of selective (antibodies) receptors. Particulary, the final objective of this thesis was focused to the development of immunochemical techniques and immunosensors for detection of quinolone antibiotic residues in milk. In this sense, the production of class selectivity antibodies for quinolones, one of the most important families in the veterinary antibiotics, has been one of the main objectives of this research. The production of antibodies has been addressed by rational design and synthesis of suitable haptens, by means chemical criteria and molecular modeling tools. The evaluation of the characteristics of the antibodies produced was performed by developing microplate ELISA test. Results show that it has been possible to obtain class selective antibodies for quinolones, able to detected up to ten quinolones with suitable detectability for the requirements of the European Commission. Moreover, protocols for the implementation of these immunochemical methods to the analysis of milk samples have been developed, establishing a semiquantitative format able to clearly identify quinolone free samples from the contaminated. Also, the established immunochemical procedures and immunoreagents developed have been implemented in an amperometric immunosensor device based on the use of magnetic particles. In this case, despite the complexity of the milk, the use of magnetic particles has allowed the elimination of potential interference by matrix components, being able to make quantitative measurements directly in milk samples without any further sample treatment or extraction step. The immunosensor is able to detect up to seven different quinolones below the maximum residue limits (MRLs) established by the European Commission for milk, offering a promising strategy for the in situ, fast, simple and inexpensive analysis of quinolones in complex samples.