Estudio de la función de Annexina A6 en el hígado

Abstract

Annexina A6 (AnxA6) es una proteína de unión a fosfolípidos de membrana de forma dependiente de calcio. Está implicada en múltiples procesos celulares como la homeostasis de colesterol y el tráfico intracelular. Partiendo de que AnxA6 es una de las proteínas más abundantes en el hígado, representando el 0.25% del total, el principal objetivo de esta tesis fue el estudio del papel de AnxA6 en este órgano a partir de ratones genoanulados para la proteína (AnxA6-/-). Teniendo en cuenta la fisiología y arquitectura comparable a los ratones WT de los hígados en ausencia de AnxA6, se procedió al estudio de AnxA6 durante el proceso de regeneración hepática tras la realización de una hepatectomía parcial (HP) de 2/3. Sorprendentemente, el 80% los ratones AnxA6-/- no sobrevivían más allá de las 72 horas post-HP. La regeneración hepática consiste en la activación de los hepatocitos por diversas citoquinas y factores de crecimiento que permiten la proliferación de las células hepáticas tras un daño hepático o una resección, como es el caso. En paralelo, el hígado y, el organismo en general, sufren una serie de adaptaciones metabólicas para mantener la homeostasis energética. El estudio del proceso de regeneración hepática demostró una menor expresión de las citoquinas TNFα e IL-6, encargadas de activar la transcripción de centenares de genes que podía estar compensada por una mayor activación del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Además, se observó cierto retraso en la acumulación de lípidos en el hígado, necesarios para hacer frente a la elevada demanda energética derivada de la intensa proliferación. Tras la HP, los ratones experimentan una hipoglucemia muy elevada fruto de la resección del 60% de la masa hepática, con lo que se reducen los almacenes de glucógeno y los hepatocitos con capacidad gluconeogénica. A diferencia de los ratones WT, los AnxA6-/- tenían una drástica y rápida caída de los niveles de glucosa en sangre que no retornaban a valores normales, sugiriendo un coma hipoglucémico como causa de la baja supervivencia. Además, el análisis de la glucosa en sangre en los ratones AnxA6-/-, hizo evidente que en ausencia de AnxA6, y ante un estrés metabólico, los ratones eran incapaces de mantener la homeostasis de glucosa. Mediante el ayuno de los ratones AnxA6-/-, se determinó que el problema en la homeostasis de glucosa no era debido ni a una señalización defectuosa por parte de las hormonas insulina y glucagón, ni por una disfunción en el almacén y degradación de glucógeno. Estos resultados centraban a la gluconeogénesis (GNG) como la causa que provoca la hipoglucemia. La GNG es el proceso mediante el cual se produce glucosa a partir de sustratos no glucídicos como lactato, aminoácidos y glicerol. Así, se descartó un problema en la expresión de las enzimas clave de la GN; glucosa-6-fosfatasa, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y fructosa-1,6-bisfosfatasa. En cambio, se observó una inhibición en la producción de glucosa a partir de alanina tanto in vivo en ratones hipoglucémicos como en hepatocitos aislados. La alanina es el principal sustrato de la GNG tanto en condiciones de ayuno como durante la regeneración hepática. Está inhibición se determinó debida a una deficiencia en la captación de alanina, tal como se observó en hepatocitos aislados. El transportador de aminoácidos SNAT2, uno de los principales transportadores de alanina, entre otros aminoácidos neutros, se ha descrito esencial durante la regeneración hepática y el ayuno. En estas situaciones se sobreexpresa el transportador y se transloca a la membrana plasmática de los hepatocitos. Tras el ayuno, los hepatocitos deficientes en AnxA6 no presentan niveles de SNAT2 en la membrana sinusoidal indicando un impedimento en el tráfico del transportador. Por último, se ha determinado mediante la técnica de pull down la interacción entre AnxA6 y SNAT2. De manera que se propone un mecanismo mediante el cual AnxA6 interacciona con SNAT2 dirigiéndolo a la membrana plasmática. Con estos resultados, hemos determinado la implicación por primera vez de AnxA6 en el metabolismo de la glucosa a través de alanina. Así, sugerimos que en ausencia de AnxA6, el transportador SNAT2 no se transloca a la membrana plasmática, quedando retenido en algún compartimento celular. De esta forma, se inhibe la GNG a partir de alanina impidiendo la producción de glucosa y provocando una situación de hipoglucemia, que en el caso de la HP podría llevar a la muerte del animal.

Annexin A6 (AnxA6) ) is a multifunctional calcium-dependent membrane binding protein involved in a plethora of different functions such as Ras-MAPK and PKCα signalling regulation, intracellular cholesterol homeostasis, actin-cytoskeleton and plasma membrane arrangement among others. Although AnxA6 is one of the major proteins in the liver (0.25% total protein), its function in the physiology of this organ remains unknown. After partial hepatectomy (PH) quiescent hepatocytes are triggered to progress through the cell cycle, showing a synchronous onset of DNA synthesis with a cellular response that involves cell activation and tissue remodelling. During this period of liver regeneration, the liver has to retain the major physiological tasks such as the synthesis and secretion of plasma proteins, lipid homeostasis and its metabolic function to ensure viability of the organism. The aim of the present study was to investigate the in vivo function of AnxA6 during liver regeneration using an AnxA6 knock-out (AnxA6-/-) mouse model. To this objective, 2/3 PH was performed in wild-type C57BL/6 control and AnxA6-/- mice. After PH, AnxA6-/- mice exhibit a dramatic reduction of survival rate (87.5% at 72h post-PHx). However, the exogenous administration of glucose before and during PH restored AnxA6-/- survival rate after PH, suggesting a link between AnxA6 and hepatic energetic metabolism. A comprehensive analysis of glucose metabolism experiments pointed to an impairment of liver gluconeogenesis in AnxA6-/- mice, also observed in starving mice. A biochemical approach allowed us to elucidate a role for AnxA6 in the intracellular trafficking of SNAT2, the main liver L-Alanine transporter, which is essential for gluconeogenic hepatic substrate uptake during liver regeneration and mice starvation. We conclude that AnxA6 is a new regulator of hepatic gluconeogenesis essential for the trafficking of the alanine transporter (SNAT2) into the hepatocyte sinusoidal plasma membrane and subsequent alanine uptake, the major gluconeogenic substrate during both liver regeneration and fasting.