L’espectrometria de masses en l’anàlisi de drogues veterinàries

Abstract

L'administració continuada d'antibiòtics veterinaris genera recel en el consumidor degut a l'increment de casos de resistència microbiana i d'al•èrgies a medicaments per la presència de residus en aliments d'origen animal. Per aquestes raons, la Unió Europea ha establert límits màxims de residus (MRL) per a les drogues veterinàries permeses en aliments d'origen animal i un nivell de concentració mínim a detectar (minimum required performance limit, MRPL) als mètodes analítics que determinen substàncies prohibides (Reglament 37/2010). Atesa la importància del control de la presència de residus d'antibiòtics en aliments d'origen animal, és necessari disposar de mètodes d'anàlisi ràpids, senzills i amb bona selectivitat i sensibilitat. Les excel•ents prestacions de l'espectrometria de masses tant pel que fa a sensibilitat, selectivitat i a la gran quantitat d'informació estructural que ofereix, especialment acoblada a tècniques de separació, fan que avui dia sigui l'eina de referència en molts laboratoris analítics per a la determinació de compostos orgànics regulats. Per aquest motiu, aquesta tesi està centrada en l'aplicació de l'espectrometria de masses a l'anàlisi de dues famílies d'antibiòtics veterinaris, els fenicols i els aminoglicòsids.

En aquesta tesi s'ha estudiat, d'una banda, la separació cromatogràfica dels compostos seleccionats (fenicols i aminoglicòsids) mitjançant cromatografia de líquids acoblada a l'espectrometria de masses amb l'objectiu de desenvolupar mètodes d'anàlisi. L'elevada polaritat dels aminoglicòsids i d'alguns dels fenicols comporta que presentin una baixa retenció en les fases estacionàries convencionals d'octadecilsilà. En aquest context, s'ha avaluat tant la utilització de fases estacionàries alternatives a les d'octadecilsilà per a afavorir la retenció de compostos polars, com els avenços en el desenvolupament de les partícules del rebliment cromatogràfic (partícules sub-2 iim i de nucli sòlid) per a millorar tant les eficàcies com les resolucions obtingudes. Per a la separació dels fenicols, els millors resultats es van obtenir amb la columna de partícula de nucli sòlid fenil-hexil, que va permetre aconseguir una separació ràpida i eficaç i amb una retenció suficient per al metabòlit polar florfenicol-amina. Pel que fa referència als aminoglicòsids, s'ha proposat l'ús d'una columna amb fase estacionària multimodal que proporciona adequada retenció i elució dels anàlits sense necessitat d’emprar formadors de parell iònic o concentracions elevades de sals en la fase mòbil. Els mètodes LC- MS/MS desenvolupats, han demostrat bons paràmetres de qualitat i s'ha aconseguit arribar a la sensibilitat necessària per a determinar els anàlits al nivell de concentració fixat pel MRL de cada matriu. D’altra banda, s’ha estudiat el comportament per espectrometria de masses de les famílies de compostos esmentades, i s’han establert les rutes de fragmentació per poder determinar les transicions més sensibles i selectives. L’estudi de les rutes de fragmentació també ha permès la identificació d’un ió característic per als fenicols, que pot ser emprat en mètodes de cribratge per a la identificació de compostos anàlegs. També s’ha estudiat la formació d'adductes en espectrometria de masses en tàndem amb diferents analitzadors de masses, fenomen que pot distorsionar els espectres de fragmentació i dificultar la identificació de compostos en base a aquests. Així, s’ha determinat que els factors clau en la formació d’aquests adductes són la configuració de l’instrument, especialment pel que respecta a la disposició de la font d’ionització, la humitat del gas de col·lisió emprat i el temps de residència en l’analitzador. Finalment, s’ha aplicat l’anàlisi per injecció en flux (FIA) acoblat a l’espectrometria de masses d’alta resolució pel desenvolupament d'un mètode de cribratge ràpid per a l'anàlisi directa i global de nous productes estupefaents. En aquest cas, s’han avaluat les estratègies d’identificació per espectrometria de masses més adients per a la identificació de compostos desconeguts que han permès identificar la presència de medicaments humans i veterinaris (benzocaïna, levamisol) com a adulterants en mostres d’estupefaents així com la presència de metamizol en una mostra fraudulenta de cocaïna.

The impact of the residues of veterinary drugs on human health is considered one of the biggest problems of the 21st century. For this reason, maximum residue levels (MRLs) for these compounds in foodstuffs of animal origin have been established in many countries. So, there is a need for fast, sensitive and selective methods for the control of the presence of said residues in foods. Liquid chromatography coupled to mass spectrometry is the technique of choice for method development, as it provides high sensitivity and selectivity and high quality spectral information.

In this work fast, sensitive and selective LC-MS methods for the determination of two families of veterinary drugs, phenicols and aminoglycosides, in foodstuffs from animal origin have been developed. The liquid chromatography separation of these polar analytes has been evaluated using different stationary phases to achieve good retention and elution for all compounds. A fused-core phenyl-hexyl column has been proposed for the separation of phenicols, whereas a mixed-mode column has been used for the highly polar aminoglycosides. Moreover, the behavior of phenicols and aminoglycosides has been studied using different atmospheric pressure ionization sources to determine the most intense and selective product ions for quantitation and confirmation and to propose their fragmentation pathways. Also, multistage tandem mass spectrometry has been utilized to propose new structures and fragmentation mechanisms for the product ions used for quantitation and confirmation of the studied compounds. Ion-molecule adduct formation inside the mass analyzer has been observed, which can lead to dubious identifications due to the presence of product ions of m/z difficult to explain. So, the importance of several factors such as instrument configuration and CID gas purity in adduct formation has been examined. Finally, the applicability of a direct analysis method such as FIA coupled to high resolution mass spectrometry has been evaluated for the wide-range screening of psychoactive substances. Data dependent analysis has been employed to obtain high quality spectral information that allowed the identification of target, suspect and unknown compounds in the samples. Moreover, the use of in silico fragmenter softwares in combination with the structural information from the product ion scan spectra has been proposed for the identification of unknown compounds.