Caracterització de la proteïna LICC1 amb els dominis LisH­-CTLH­-CRA de blat de moro

Abstract

En aquesta Tesi s'han estudiat tres gens a partir d'una llibreria de cDNA d'embrions de blat de moro de 10 DAP. Els tres cDNAs escollits van ser: MKA5, que codifica un pèptid antimicrobià de la família CYCLOTIDE; MMH3, que codifica una proteïna de la família de MAP65 associades a microtúbuls, i MIH1, que codifica la proteïna LICC1 involucrada en diferents processos biològics.

La proteïna LICC1 conté els dominis LisH, CTLH i CRA. La funció del domini LisH és la d'interactuar amb els microtúbuls i altres proteïnes. Les funcions dels dominis CTLH i CRA sembla ser la d'interactuar amb d'altres proteïnes. Un estudi filogenètic mostra que LICC1 és homòleg a les proteïnes GID8 i TWA1 de llevat i mamífers, respectivament, que formen part del complex proteic GID/MRCTLH. Aquest complex sembla que participa en múltiples funcions cel•lulars, entre les que es troba la degradació de certes proteïnes via ubiquitinació. E1 gen liccl s'expressa més o menys a tots els teixits i la seva proteïna s'acumula també a molts teixits, tot i que presenta diferents formes probablement degudes a modificacions post-traduccionals. S'ha demostrat mitjançant la centrifugació diferencial que LICC1 està associada a complexos d'alt pes molecular. Experiments de cosedimentació demostren que LICC1 interactua amb els microtúbuls i experiments in vivo amb plantes i cèl•lules transformades de tabac i d'Arabidopsis amb fusions de LICC1 a YFP demostren que LICC1 colocalitza amb les tubulines com a mínim en certs teixits i condicions ambientals. Tractaments amb drogues que afecten als microtúbuls produeixen variacions en la localització de LICC1. La part de LICC1 responsable de la interacció amb els microtúbuls es la que conté els dominis LisH i CTLH. Davant d'un estrès hídric LICC1 passa a estar localitzat als cossos lipídics sent el domini CRA la part responsable de l'interacció amb proteïnes. En vaquestes condicions l'acumulació de LICC1-YFP s'incrementa a les cèl•lules de guarda dels estomes. A més a més, la sobreexpressió de LICC1-YFP produeix una reducció en el creixement però un increment en la resistència a l'estrès hídric. Experiments d'immunoprecipitació han demostrat que LICC1 es capaç també d'interactuar amb una polifenol oxidasa.

Amb aquests resultats suggereix que LICC1 formaria part del complex GID/MRCTLH i participaria en múltiples funcions. Aquest complex podria associar-se als cossos lipídics en condicions d'estrès, a on podria actuar com scaffold i interactuar amb d'altres proteïnes, per exemple, promovent la seva ubiquitinació. Una d'elles podria ser la PPO detectada.

Transcriptomic analyses have identified the genes expressed during plant embryogenesis but the roles of may of them remain unknown. The present work describes the molecular studies of three genes expressed in maize embryos 10 days after pollination. The first gene encodes an antimicrobial peptide from the CYCLOTIDE family. The second gene encodes a MAP65 family protein associated with microtubules. The last gene encodes the protein LICC1 involved in several biological processes.

Gene /icc/ encodes a protein with the LisH, CTLH and CRA domains, all three described as protein-protein interaction domains. LisH has been also involved in microtubule interactions. LICC1 is homologous to yeast GID8 and human TWA1, both components of the protein complex GID/MRCTLH, which act as an ubiquitin E3 ligase involved in several cell processes. Gene /icc/ is expressed in all plant organs and LICC1 protein accumulated in all them although it seems to suffer different postranslational modifications depending on the organ. The cellular distribution of LICC1 is complex. Differential centrifugation showed that part of the LICC1 is located in high molecular weight protein complexes, as expected for a GID/MRCTLH component. Cosedimentation experiments demonstrated that LICC1 interacts with microtubules, as expected for a LisH domain containing protein. This interaction was confirmed in vivo by the colocalization of LICC1-YFP with tubulins and the use of drugs altering microtubule stability. The fragment of LICC1 containing the LisH and CTLH domains is the responsible for the microtubule interaction. Under certain conditions LICC1 is located in the oil bodies, being the fragment containing the CRA domain the responsible for this localization. Immunoprecipitation demonstrated that LICC1 also interacts with a polyphenol oxidase. Overexpression of LICC1 fused to YFP produces a reduction in the growing rates but in Arabidopsis plants overexpression of LICC1-YFP increases the resistance to water stress. Under such stress conditions, LICC1-YFP accumulation is increased in the stomatal guard cells. In conclusion, LICC1 seems to be part of the GID/MRCTLH complex in plants and to be involved in several cellular processes, including growth, water stress response and ROS responses through the interaction with a polyphenol oxidase.