Estudis experimentals sobre els efectes fisiopatològics de la depleció del DNA mitocondrial

Abstract

El principal lloc de producció d’energia química en forma útil per a processos metabòlics a la cèl•lula de mamífer és la mitocòndria. Aquests orgànuls estan especialitzats en la síntesi d’ATP, i per dur a terme aquest procés utilitzen el sistema enzimàtic cadena respiratòria/fosforilació oxidativa (OXPHOS). Les mitocòndries participen també en altres funcions com són el cicle de Krebs, β-oxidació dels àcids grassos, apoptosi, etc. La funció mitocondrial en mamífers consta d’una característica única respecte altres funcions: la participació del DNA mitocondrial (mtDNA). L’expressió coordinada del mtDNA i del genoma nuclear és essencial per a la correcta síntesi del sistema OXPHOS. El mtDNA és un sistema genètic que consta d’un nombre variable de còpies de DNA circular (103-104/cèl•lula) transmeses de generació en generació per herència materna i la seva expressió està dirigida per proteïnes d’origen nuclear. L’expressió del mtDNA és regulada també a nivell de la replicació d’aquest, i per tant el nombre de còpies de mtDNA per cèl•lula determinarà també la funció mitocondrial. Les malalties mitocondrials poden ser causades per mutacions del mtDNA o bé de gens nuclears que codifiquen per proteïnes amb funció mitocondrial. La síndrome de depleció del mtDNA (MDS) es caracteritza per una reducció en el nombre de copies del mtDNA, i forma part d’un grup heterogeni de malalties que s’hereten de forma autosòmica recessiva. En la present Tesi, hem demostrat com en un pacient de MDS per mutació de la timidina quinasa 2 (TK2), que presentava una progressió inusualment lenta, es produïa una selecció de miofibres de tipus I respecte tipus II al múscul esquelètic com a mecanisme compensatori de la manca de mtDNA. L’estudi de fibroblasts derivats de pacients deficients per TK2 amb depleció del mtDNA ens va permetre elucidar mecanismes moleculars que podrien estar jugant un paper compensatori, regulant l’expressió de proteïnes implicades en el procés, com ara el transportador ENT1. Paral•lelament varem desenvolupar un model cel•lular de depleció del mtDNA per deficiència de TK2 mitjançant siRNA. A més a més de la depleció de mtDNA d’origen genètic també es produeix una depleció notable en individus VIH-1 positius tractats amb antiretrovirals. La lipodistròfia associada al VIH-1 és una malaltia caracteritzada per una redistribució anòmala del teixit adipós, que presenta uns aspectes clínics heterogenis, i on els pacients afectats són propensos a la resistència a la insulina i a d’altres complicacions metabòliques. Es coneix que el mtDNA juga un paper clau en la biologia del teixit adipós i en la regulació del metabolisme. Els mecanismes responsables de la lipodistròfia poden separar-se entre els que estan directament relacionats amb la mitocòndria, i els que no (inhibició de l’adipogènesi i processos inflamatoris). En la present Tesi hem analitzat la biologia del teixit adipós en dos models de ratolí: el primer, un model de depleció del mtDNA per deficiència de TK2, presentava una preservada funció del teixit adipós marró amb alteracions moderades pel que fa a la morfologia i funció mitocondrials. En segon lloc, un ratolí transgènic pel VIH-1 indicà que bona part de les alteracions característiques de la lipodistròfia associada al VIH-1 en el teixit adipós eren reproduïbles en un model animal sense comportar canvis en els nivells i expressió del mtDNA. Finalment, estudis en pacients VIH-1 ens mostraren que el tractament amb inhibidors de proteasa pot donar lloc a efectes positius, com la reducció de l’apoptosi d’origen mitocondrial, sense això comportar una millora en el grau de depleció del mtDNA. L’estudi dels mecanismes compensatoris de la depleció del mtDNA emprats per la cèl•lula de forma natural és important ja que poden constituir potencials dianes d’intervenció terapèutica en el tractament de les patologies per depleció del mtDNA.

The main site of production of chemical energy for metabolic processes in the mammalian cell is the mitochondria. These organelles are specialized in the synthesis of ATP using the respiratory chain/oxidative phosphorylation system (OXPHOS). Mitochondria are also involved in other functions such as the Krebs cycle, β-oxidation of fatty acids, apoptosis, etc. The mitochondrial function in mammals has a unique feature compared to other functions: the involvement of mitochondrial DNA (mtDNA). The coordinated expression of the mtDNA and the nuclear genome (nDNA) is essential for the proper synthesis of the OXPHOS system. The mtDNA is a genetic system consisting of a variable number of copies of circular DNA (103-104/cell) transmitted from generation to generation by maternal inheritance. mtDNA expression is directed nDNA-encoded proteins. The expression of mtDNA is also regulated at the level of replication, and therefore the number of copies of mtDNA per cell will determine the mitochondrial function. In this thesis we have conducted experimental studies of the pathophysiological effects of mtDNA depletion in cell culture, mouse models and also in patients, with special attention to the biology of mitochondrial DNA in adipose tissues. In the study of an mtDNA depletion syndrome (MDS) patient, we demonstrated that there was a selection of type I respect to type II fibers in skeletal muscle. Moreover, fibroblasts derived from MDS patients showed molecular mechanisms that could be playing a compensatory role, regulating the expression of nucleoside transporters, such as ENT1. On the other hand, a murine model of mtDNA depletion showed a preserved function of brown adipose tissue with moderate alterations in terms of morphology and mitochondrial function. Finally, studies in HIV-1 patients showed that treatment with protease inhibitors can result in positive effects, such as reduction of mitochondrially-driven apoptosis, without improving the degree of mtDNA depletion. In summary, we’ve been able to elucidate some candidates to be natural compensatory mechanisms of mtDNA depletion. These cellular compensatory mechanisms of mtDNA depletion are very important as they may be potential targets for therapeutic intervention in treating mtDNA depletion-related diseases.