Correction of point mutations at the endogenous locus of the mammalian dihydrofolate reductase gene using polypurine reverse hoogsteen hairpins

Abstract

This work is focused on the study of Polypurine Reverse Hoogsteen (PPRH) hairpins and their ability as gene correction tools.

The repair of a point mutation at its endogenous gene locus has been the focus of many researchers during the past decades by using various approaches such as gene replacement, gene augmentation therapy (GAT) and different repair oligonucleotides. Cystic fibrosis, sickle-cell anemia and Tay-Sachs disease are some examples of the high number of disorders caused by a single-point mutation. In this work we present an alternative repair methodology using PPRH molecules, that although first developed in our laboratory as a gene-silencing tool, we hypothesized that they could also be applied as a gene correction tool.

PPRHs are double-stranded DNA molecules formed by two antiparallel homopurine domains linked by a 5-thymidine loop, which form intramolecular reverse Hoogsteen bonds. PPRHs have been described to effectively bind to the dsDNA forming a triplex structure (Coma et al., 2005), and have been designed against either the template or the coding strand of the dsDNA (de Almagro et al., 2009, de Almagro et al., 2011a).

Taking advantage of the ability of PPRHs to form a triplex structure with the pyrimidine strand of the dsDNA, in the present work we wanted to explore the ability of PPRHs to correct point mutations. First of all, we studied the in vitro conditions for PPRHs to bind to dsDNA and to maintain it in an open conformation by binding assays. Then, we designed different repair-PPRHs by adding to the PPRH core a repair tail complementary to the mutated region of the DNA except for the nucleotide to be corrected. These repair-PPRHs were used in mammalian cells to repair a point mutation in a dihydrofolate reductase (dhfr) plasmid.

Finally, those results led us to further demonstrate the correction capability of repair-PPRHs in different mutant cell lines containing single point mutations in the endogenous dhfr gene. In addition, we developed improved Long-distance-repair¬PPRHs (LDR-PPRHs) to correct mutations that are very distant with respect to the DNA target where the PPRH core binds.

Considering the possible high proportion of guanines in a PPRH sequence, an in vitro characterization of these molecules was carried out to study the effect of these guanines in the formation of secondary structures, such as G-quadruplex. The triplex conformation formed by repair-PPRHs with their pyrimidine target sequences was also studied even when repair-PPRHs folded in a G-quadruplex structure instead of a hairpin.

As a second part of this thesis, we developed a new application of the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) technique, to demonstrate the binding between miRNAs and their target sequences. For over two decades, research in our laboratory has been focused on the pharmacogenomic study of methotrexate (MTX) resistance in cancer chemotherapy upon inhibition of DHFR. Beside gene amplification, our research group has shown that many genes are involved in this mechanism. In this direction, cellular genes and micro-RNAs such as miR-224 and its target genes SLC4A4, CDS2 and HSPC159 were identified to play an important role in the resistance to MTX in colon cancer cells (Mencia et al., 2011). For this reason, miR-224 was chosen to show in a direct and specific manner, its ability to bind to the SLC4A4 target gene, thus setting up the EMSA as a simple and useful method to validate the interaction between a miRNA and a specific mRNA target.

Aquest treball es centra en l'estudi de pinces de polipurines "polypurine reverse Hoogsteen (PPRH)", i la seva capacitat com eina en la correcció de gens.

La reparació d'una mutació puntual en el seu locus endogen ha sigut el principal tema de molts investigadors en les últimes dècades, utilitzant diverses estratègies com per exemple la teràpia de substitució de gens (GAT) i diferents oligonucleòtids de reparació. La fibrosi quística, anèmia de cèl.lules falciformes i la malaltia de Tay-Sachs son alguns exemples de la gran quantitat de trastorns causats per una mutació puntual. En aquest treball, presentem una metodologia de reparació alternativa que utilitza molècules PPRH, desenvolupades en el nostre laboratori inicialment com a eina de silenciament gènic, amb la hipòtesi que també es podrien aplicar com a eina de correcció de gens. Els PPRH son unes molècules d'ADN de doble cadena, formades per dos dominis de homopurines antiparal•eles, connectades per un bucle de 5 timidines, que formen enllaços de Hoogsteen reversos i intramoleculars. Els PPRHs s'han descrit per unir-se eficaçment a la doble cadena d'ADN formant una estructura de tríplex, i han sigut dissenyats tant contra la cadena motlle com contra la cadena codificant de l'ADN.

Tenint en compte la capacitat dels PPRHs per formar una estructura de tríplex amb la cadena de pirimidines de l'ADN, en l'estudi presentat aquí volíem explorar la capacitat dels PPRHs per corregir mutacions puntuals. En primer lloc, es van estudiar les condicions in vitro en les que els PPRHs s'unien a la doble cadena de l'ADN i la mantenien oberta, mitjançant assajos d'unió. Tot seguit, hem dissenyat diferents PPRHs reparadors, tot afegint, al nucli del PPRH, una cua reparadora, complementaria a la regió mutada de l'ADN excepte pel nucleòtid que ha de ser corregit. Aquests PPRHs reparadors s'han utilitzat en cèl.lules de mamífer per reparar una mutació puntual en un plàsmid de la dihydrofolate reductasa (dhfr). Per últim, els resultats positius ens van portar a estudiar la capacitat dels PPRHs reparadors per reparar diferents línies cel.lulars que contenien diferents tipus de mutacions puntuals en el gen endogen de la dhfr. A més, també hem desenvolupat un PPRH millorat, anomenat LDR-PPRH, per "Long-Distance-Repair-PPRH", per reparar mutacions puntuals molt distants respecte la seqüència diana del nucli del PPRH.

Tenint en compte la possible alta proporció de guanines en una seqüència de PPRH, es va dur a terme una caracterització in vitro d'aquestes molècules per estudiar l'efecte de les guanines en la formació d'estructures secundàries, com per exemple els G-quàdruplex. També es va estudiar la conformació de triple hèlix formada pels PPRH reparadors amb les seves seqüències diana de pirimidines, fins i tot quan el PPRH reparador es plega en una estructura de G-quàdruplex enlloc de en forma de pinça.

Com a segona part de la tesi, hem desenvolupat una nova aplicació de la tècnica d'assaig de canvi de mobilitat electroforètica (EMSA), per demostrar la unció entre els miRNAs i les seves seqüències diana. Durant més de dues dècades, la investigació en el nostre laboratori s'ha centrat en l'estudi farmacogenòmic de la resistència al metotrexat (MTX) en la quimioteràpia contra el càncer, per la inhibició del gen de la dhfr. A més de l'amplificació gènica, el nostre grup ha demostrat que molts gens estan involucrats en el mecanisme, així com també hi estan involucrats els micro-RNAs. El miR-224 i els seus gens diana, SLC4A4, CDS2 i HSPC159 van ser identificats per jugar un paper important en la resistència al MTX en cèl.lules de càncer de colon. Per aquesta raó, el miR-224 va ser l'escollit per mostrar d'una manera directa i específica, la seva habilitat per unir-se al gen diana SLC4A4, establint així la tècnica d'EMSA com un mètode senzill i útil per validar la interacció entre un miRNA i la seva diana específica de mRNA.