Diversidad genética, genes de virulencia y estructuras de superficie implicadas en la patogenicidad del género Aeromonas

Abstract

Recientemente se ha reconocido la patogenicidad de Aeromonas en cuadros gastrointestinales del hombre y de los animales (Chopra y Houston, 1999; Janda et al., 2010). Se han publicado nuevos estudios que amplían el conocimiento de su taxonomía, los factores asociados a su virulencia, así como también, la frecuencia de su resistencia a los antibióticos, especialmente en las especies causantes de infecciones graves como Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae y Aeromonas veronii subsp. sobria (Albarral 2013; Ghenghesh et al., 2014; Fatima et al., 2013). Se han aislado causando procesos infecciosos graves como bacteriemias, heridas, endocarditis, meningitis y neumonías (Tequianez et al., 2005; Rodríguez et al., 2005; Fátima et al., 2013; Grim et al., 2013). Existen diferentes factores de virulencia, principalmente citotoxinas, enterotoxinas, hemolisinas, proteasas, gelatinasas, ADNasas y otros que pueden determinar su patogenicidad (Ghenghesh et al., 2014; Grim et al., 2013).

En el medio ambiente, Aeromonas es muy ubicua y está ligada al ambiente acuático. Los datos epidemiológicos sugieren fuertemente que muchas de las infecciones son adquiridas a través del consumo de agua y/o alimentos contaminados (Chopra y Houston, 1999; Janda et al., 2010; Carvalho et al., 2012), aunque por el momento no se han descrito los linajes predominantes en ambos ecosistemas.

La Hipótesis de esta Tesis Doctoral fue que los aislados de Aeromonas de muestras clínicas humanas que producen cuadros invasivos, poseen factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad distintos a las muestras medioambientales, y además corresponden a linajes genéticos diferentes. Nuestro Objetivo General fue caracterizar fenotípica y genotípicamente una colección de cepas de Aeromonas de distintos orígenes en relación con su patogenicidad.

Para llevar a cabo este estudio se realizó en primer lugar un estudio retrospectivo de la prevalencia y su evolución en el tiempo (1996-2014) de Aeromonas en muestras clínicas del Hospital Universitario Ramón y Cajal de Madrid. También se creó una colección de 40 cepas de diferentes orígenes [ambientales del Río Loa, Antofagasta en Chile (n=6), aguas residuales de Túnez (n=5), diarrea (n=19), bacteriemia (n=9), y neumonía (n=1)] y se les realizó diferentes análisis fenotípicos, bioquímicos y moleculares. En todas las cepas se determinó la sensibilidad a antibióticos, la presencia de factores de virulencia y su diversidad clonal mediante electroforesis en campo de pulso. Posteriormente, 15 cepas seleccionadas fueron tipadas mediante MultiLocus Sequence Typing (MLST) y en ellas también se estudió la variabilidad de la estructura de su lipopolisacárido. Finalmente en 6 cepas se analizó su adherencia a la línea celular Caco-2 y su capacidad de invasión.

Los resultados mostraron que A. hydrophila (84%) es la especie más prevalente en nuestras muestras clínicas seguida por A. caviae (12%). El número de muestras con Aeromonas se ha duplicado desde 1996 hasta 2014, siendo las heces la muestra mayoritaria con diferencia. Dentro de nuestra colección de 40 cepas, no se evidenció resistencia a los antibióticos y las cepas clínicas portaban mayor número de genes de virulencia, en comparación que las ambientales. Los estudios de campo pulsado mostraron una gran diversidad genética y las 15 tipadas mediante MLST se correspondieron con STs no descritas. La estructura del LPS fue cepa-dependiente, correspondiéndose las estructuras más complejas con las cepas de origen clínico. A pesar de su origen invasivo, nuestras cepas no presentan capacidad para invadir e internalizarse dentro de las células Caco2 diferenciadas a mucosa intestinal. Finalmente, y a modo de conclusión general, podemos que al igual que ocurre en otros microorganismos, la virulencia y patogenicidad debe ser demostrada a nivel de cada cepa, ya que no se puede generalizar dentro de una misma especie, y que el estado inmunológico del huésped también juega un relevante papel en la infección por Aeromonas.

In the last years, several studies demonstrating the pathogenicity of the Aeromonas genera, their taxonomic updates, their virulence factors and their antimicrobial resistance profile. Aeromonas are very ubiquitous in the environment and it is linked to aquatic ecosystems. The epidemiology strongly suggests that infections are a consequence of the contact with contaminated water and/or food. In spite of this, the predominant lineages linked to human infections have not been described.

Our Hypothesis was that clinical human strains possess different virulence factors than those from environmental origin, and corresponds with different genetic lineages. The Aim was to characterize an Aeromonas collection from different origins.

First, we realized a retrospective study between 1996-2014 of the Aeromonas clinical strains collected at the University Hospital Ramon and Cajal. Second, we collected 40 strains of different origins [Rio Loa, Antofagasta in Chile (n=6), waste water of Tunis (n=5), diarrhoea (n=19), bacteraemia (n=9), and pneumonia (n=1)]. All strains were identify and we determine their virulence factors, their antibiotics susceptibility and their genetic diversity by PFGE. Furthermore, 15 selected strains were typed by MLST and also analyzed the lipopolysaccharide. Finally, the adherence/invasion ability of 6 strains to Caco-2 was evaluated.

The results showed that A. hydrophila (84 %) is the more prevalent specie in our clinical samples followed for A. caviae (12 %). Their frequency has doubled from 1996 to 2014, being the faeces the most frequent sample. Inside our collection of 40 strains, antibiotic resistance was not observed and the clinical strains carried more virulence genes than the environmental ones. The PFGE studies showed a great genetic diversity and the 15 MLST-typed strains corresponded with not previously described STs. The lipopolysaccharide structure was strain dependent, and the most complex structures correspond to clinical isolates. Our strains were unable to invade the Caco2 cells differentiated to mucous intestinal. Finally, and as general conclusion, the virulence and pathogencity might be studied to level for each strain individually, since it is not possible to generalize inside the same species. In addition, the immunological condition of the patients also might play a relevant role in the Aeromonas infection.