Development of biomaterial self-assembling based platforms to obtain human cartilage tissue in vitro

Abstract

El cartílag articular té una capacitat limitada de creixement i regeneració i, els tractaments per restaurar la funció del teixit, després d’una lesió, són limitats i poc entesos per la comunitat mèdica. Existeix, per tant, un gran interès en trobar una solució pràctica i agradable pel pacient que aconsegueixi la reparació del cartílag. La enginyeria de teixits va sorgir per restablir teixits danyats usant noves plataformes terapèutiques basades en cèl·lules i/o biomaterials. Aquestes noves teràpies pretenen crear estructures similars al cartílag que imiten les propietats mecàniques i biològiques que trobem in vivo. En aquest context, l’ús de matrius biomimètiques que reprodueixin estructural i funcionalment el microambient natiu han despertat gran interès en aquest camp. Els pèptids auto-ensamblants representen candidats ideals per crear nínxols cel·lulars, ja que les seves nanofibres i propietats biomecàniques son similars a les de la matriu extracel·lular. En aquesta tesi, s’ha desenvolupat nous biomaterials sintètics amb gran potencial per la reparació de cartílag. Aquests estan basats en el pèptid auto-ensamblant RAD16-I decorat amb motius bioactius, amb l’objectiu de reproduir la matriu del cartílag. Donada la versatilitat del hidrogel RAD16-I, les noves matrius es van formar per simple mescla del pèptid RAD16-I amb molècules d’heparina, condroitin sulfat i decorina. Aquestes matrius bi-composades presenten bona estabilitat química i estructural a pH fisiològic i son capaces d’unir i alliberar, gradualment, factors de creixement. L’avaluació d’aquestes matrius es va dur a terme mitjançant dues estratègies in vitro diferents: la rediferenciació de condròcits articulars humans i la inducció del llinatge condrogènic en cèl·lules mare derivades de teixit adipós. Ambdós tipus cel·lulars son considerats una bona font cel·lular per obtenir constructes que reparin defectes al cartílag. Els resultats presentats en aquest treball mostren diferencies a nivell de comportament cel·lular, patrons d’expressió i propietats mecàniques entre els dos tipus cel·lulars i les diferents condicions de cultiu (matrius i medis). Cal destacar que els dos tipus cel·lulars es diferencien a un llinatge condrogènic en medi d’inducció i que els constructes presenten propietats mecàniques compatibles amb un sistema condrogènic. A més s’ha determinat que la presencia de molècules d’heparina a la matriu promou la supervivència de les cèl·lules mare derivades de teixit adipós. En conjunt, les noves matrius bi-composades representen un material fàcil de preparar i prometedor per promoure la diferenciació condrogènica. Finalment, part d’aquesta tesi s’ha centrat en el desenvolupament d’una nova matriu composta mitjançant la infiltració del pèptid RAD16-I amb cèl·lules en microfibres de policaprolactona (PCL). S’ha demostrat que aquesta nova combinació ofereix una estructura funcional i biomimètica, ja que proporciona suport mecànic per les fibres de PCL i a la vegada, facilita l’adhesió i el creixement cel·lular per l’hidrogel RAD16-I. El cultiu in vitro de condròcits humans desdiferenciats demostra que la nova matriu composada promou la supervivència cel·lular i el restabliment del llinatge condrogènic. En general, les propietats sinèrgiques de la nova matriu composada proporcionen una plataforma terapèutica ideal per ajudar a la reparació del cartílag.

El cartílago articular tiene una capacidad limitada de crecimiento y regeneración y, los tratamientos para restaurar la función del tejido, después de una lesión, son limitados y poco entendidos por la comunidad médica. Existe, por tanto, un gran interés en encontrar una solución práctica y agradable para el paciente que consiga la reparación del cartílago. La ingeniería de tejidos surgió para restaurar tejidos dañados usando nuevas plataformas terapéuticas basadas en células y/o biomateriales. Estas nuevas terapias pretenden crear estructuras similares al cartílago que imiten las propiedades mecánicas y biológicas que se dan in vivo. En este sentido, el uso de matrices biomiméticas que reproduzcan estructural y funcionalmente el microambiente nativo ha generado gran interés en este campo. Los péptidos auto-ensamblantes representan candidatos ideales para crear nichos celulares dado que, sus nanofibras y propiedades biomecánicas son similares a las de la matriz extracelular. En esta tesis, se han desarrollado nuevos biomateriales sintéticos con gran potencial para la reparación de cartílago. Éstos, están basados en el péptido auto-ensamblante RAD16-I decorado con motivos bioactivos, tratando de reproducir la matriz del cartílago. Dada la versatilidad del hidrogel RAD16-I, las nuevas matrices se formaron por simple mezcla del péptido RAD16-I con moléculas de heparina, condroitin sulfato y decorina. Estas matrices bi-compuestas presentan buena estabilidad química y estructural a pH fisiológico y son capaces de unir y liberar, gradualmente, factores de crecimiento. La evaluación de estas matrices se llevó a cabo mediante dos estrategias in vitro diferentes: la rediferenciación de condrocitos articulares humanos y, la inducción del linaje condrogénico en células madre derivadas de tejido adiposo. Ambos tipos celulares son considerados una buena fuente de células para obtener constructos que reparen defectos en el cartílago. Los resultados presentados en este trabajo muestran diferencias a nivel de comportamiento celular, patrones de expresión y propiedades mecánicas entre los dos tipos celulares y las diferentes condiciones de cultivo (matrices y medios). Cabe destacar que, ambos tipos celulares se diferencian a un linaje condrogénico en medio de inducción y que los constructos presentan propiedades mecánicas compatibles con un sistema condrogénico. Además, se ha determinado que la presencia de moléculas de heparina en la matriz promueve la supervivencia de las células madre derivadas de tejido adiposo. En conjunto, las nuevas matrices bi-compuestas representan un material fácil de preparar y prometedor para promover la diferenciación condrogénica. Por último, parte de esta tesis se ha centrado en el desarrollo de una nueva matriz compuesta mediante la infiltración del péptido RAD16-I con células en microfibras de policaprolactona (PCL). Se ha demostrado que esta nueva combinación ofrece una estructura funcional y biomimética, dado que, proporciona soporte mecánico por las fibras PCL y a su vez, facilita la adhesión y el crecimiento celular debido al hidrogel RAD16-I. El cultivo in vitro de condrocitos humanos desdiferenciados demuestra que la nueva matriz compuesta promueve la supervivencia celular y el restablecimiento del linaje condrogénico. En general, las propiedades sinérgicas de la nueva matriz compuesta proporcionan una plataforma terapéutica ideal para ayudar a la reparación del cartílago.

Adult articular cartilage has a limited capacity for growth and regeneration and, after injury, treatments to restore tissue function remain poorly understood by the medical community. Therefore, there is currently great interest in finding practical and patient-friendly strategies for cartilage repair. Tissue engineering has emerged to restore damaged tissue by using new cellular or biomaterial-based therapeutic platforms. These approaches aim to produce cartilage-like structures that reproduce the complex mechanical and biological properties found in vivo. To this end, the use of biomimetic scaffolds that recreate structurally and functionally the native cell microenvironment has become of increasing interest in the field. Self-assembling peptides are attractive candidates to create artificial cellular niches, because their nanoscale network and biomechanical properties are similar to those of the natural extracellular matrix (ECM). In the present thesis, new composite synthetic biomaterials were developed for cartilage tissue engineering (CTE). They were based on the non-instructive self-assembling peptide RAD16-I and decorated with bioactive motifs, aiming to emulate the native cartilage ECM. We employed a simple mixture of the self-assembling peptide RAD16-I with either heparin, chondroitin sulfate or decorin molecules, taking advantage of the versatility of RAD16-I. The bi-component scaffolds presented good structural and chemical stability at a physiological pH and the capacity to bind and gradually release growth factors. Then, these composite scaffolds were characterized using two different in vitro assessments: re-differentiation of human articular chondrocytes (ACs) and induction of human adipose derived stem cells (ADSCs) to a chondrogenic commitment. Both native chondrocytes and adult mesenchymal stem cells (MSCs), either bone marrow or adipose-tissue derived, are considered good cell sources for CTE applications. The results presented in this work revealed differences in cellular behavior, expression patterns and mechanical properties between cell types and culture conditions (scaffolds and media). Remarkably, both cell types underwent into chondrogenic commitment under inductive media conditions and 3D constructs presented mechanical properties compatible to a system undergoing chondrogenesis. Interestingly, as a consequence of the presence of heparin moieties in the scaffold cell survival of ADSCs was enhanced. Altogether, the new bi-component scaffolds represent a promising "easy to prepare" material for promoting chondrogenic differentiation. Finally, part of this thesis was focus on developing a composite scaffold by infiltrating a three-dimensional (3D) woven microfiber poly (ε-caprolactone) (PCL) scaffold with the RAD16-I self-assembling peptide and cells. This new combination resulted into a multi-scale functional and biomimetic tissue-engineered structure providing mechanical support by PCL scaffold and facilitating cell attachment and growth by RAD16-I hydrogel. The in vitro 3D culture of dedifferentiated human ACs evidenced that the new composite supports cell survival and promotes the reestablishment of the chondrogenic lineage commitment. Overall, the synergistic properties of the novel composite scaffold may provide an ideal therapeutic platform to assist cartilage repair.