Stability and folding of G-protein coupled receptors associated to degenerative diseases

Abstract

G-protein coupled receptors (GPCRs) are the largest membrane protein superfamily encoded by the human genome and represent the largest class of drug targets for a wide range of pathological conditions. Two GPCRs members, the visual pigment rhodopsin associated with the retinal degenerative disease retinitis pigmentosa (RP), and the muscarinic acetylcholine (ACh) 3 receptor (M3R) associated with Alzheimer’s disease (AD), are studied in this thesis. Rhodopsin is the prototypical visual photoreceptor mediating scotopic vision and distributed throughout the retina. Upon illumination, the bound chromophore 11-cis-retinal isomerizes to all-trans-retinal and triggers the visual signaling cascade. Mutations found in rhodopsin, such as G90V and N55K, are responsible for the retinal degenerative disease RP. To counteract the low structural stability of these mutants, and to provide a deeper understanding of the molecular mechanisms leading to visual dysfunction, artificial membranes in the form of DMPC/DHPC bicelles and DDHA-PC liposomes were prepared. DMPC/DHPC bicelles and DDHA-PC liposomes provided a native-like bilayer environment, which preserved rhodopsin wild type and mutants structure and increased their thermal stability to varying degrees compared to the usual dodecyl maltoside (DM) detergent. Furthermore, chromophore regeneration of G90V and N55K mutants in DMPC/DHPC bicelles condition was enhanced compared to DM condition. Moreover, the kinetics for the active state metarhodopsin II (Meta II) decay indicated that retinal release rates of G90V and N55K mutants became faster in the presence of DMPC/DHPC bicelles and DDHA-PC liposomes compared to DM condition. The addition of hydroxylamine upon Meta II complete decay of WT and G90V in bicelles increased fluorescence intensity, suggesting that retinal can be retained inside the binding pocket. DMPC/DHPC bicelles and DDHA-PC liposomes provided stable conditions so that G90V opsin, obtained after Meta II completely decay, was able to regenerate upon the addition of exogenous retinal. On the other hand, N55K was not able to regenerate, indicating that the molecular mechanisms associated to this mutant has important differences which may be associated with their specific clinical phenotypes. The interactions between rhodopsin and arrestin, and between M3R and tau protein are studied in their association with the degenerative diseases, RP and AD respectively. Active rhodopsin bound R175E mutant arrestin and slowed down the retinal release from the binding pocket. Arrestin binding assays on mutants associated to RP would help uncover mechanisms related to visual cascade termination, not studied so far. M3R plays a role in muscarinic ACh signal transmission and on ion channels function especially in the central nervous system (CNS). In the M3R-tau interaction studies, M3R WT and mutants N132G and D518N did change the location of tau from the cytoplasm to the membrane when they were coexpressed in HEK293T cells. M3R mutants D518K and K523Q were affected when coexpressed with tau and trafficked from the membrane to the cytoplasm. These shifts in location likely result from the interaction between tau and M3R WT and mutants. This finding provides new clues about the specific tau binding/recognition sites on M3R and the possible involvement of such interaction in the pathophysiology of AD. Overall, the artificial membranes DMPC/DHPC bicelles and DDHA-PC liposomes systems provide a better bilayer environment to stabilize rhodopsin WT and mutants than DM detergent environment thus reverting their intrinsic thermal sensitivity. The different behavior of G90V and N55K in artificial membranes could be associated with their specific clinical phenotypes. On the other side, the results obtained on the interaction between GPCRs and other proteins provide a foundation for further studies associated with GPCRs mutants and degenerative diseases

Los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) representan la mayor superfamilia de proteínas de membrana codificada por el genoma humano y también la mayor clase de dianas terapéuticas para diversas enfermedades. En esta tesis se estudian dos miembros de los GPCRs; el pigmento visual rodopsina, asociado con la enfermedad degenerativa de la retina retinitis pigmentosa (RP) y el receptor de acetilcolina (ACh) muscarínico 3 (M3R) asociado con la enfermedad de Alzheimer (AD). La rodopsina es el fotorreceptor visual prototípico responsable de la visión escotópica y se encuentra distribuido por toda la retina. Después de la iluminación, el cromóforo 11-cis-retinal se isomeriza a todo-trans-retinal y desencadena serie de reacciones intracelulares llegando al nervio óptico y permitiendo la unión. Mutaciones en rodopsina, tales como G90V y N55K son causantes de RP. Para entender más profundamente los mecanismos moleculares causantes de esta disfunción visual debido a estas mutaciones, se han preparado membranas artificiales tales como bicelas de DMPC/DHPC y liposomas de DDHA-PC. Estos sistemas lipídicos ofrecen un entorno bicapa más nativo, comparado con el que proporciona el detergente dodecil maltosido (DM), usado más tradicionalmente, lo que preserva la estructura de la rodopsina nativa y de los mutantes y aumenta su estabilidad térmica. La regeneración cromóforo para de G90V y N55K en bicelas de DMPC/DHPC es más elevada en comparación con el valor obtenido en DM. La cinética de decaimiento de la conformación activa metarodopsina II (Meta II) indica que la velocidad de liberación del retinal de los mutantes G90V y N55K es más alta en presencia de las bicelas de DMPC/DHPC, y de los liposomas de DDHA-PC, en comparación con las velocidades obtenidas en DM. La adición del reactivo hidroxilamina después del decaimiento completo de Meta II de WT y del mutante G90V en las bicelas provoca un incremento de la intensidad de fluorescencia, indicando que parte de Meta II aún mantiene el retinal en su sitio de unión. Las bicelas de DMPC/DHPC y los liposomas de DDHA-PC también estabilizan la opsina del mutante G90V, obtenida después del decaimiento de Meta II, pudiendo ser regenerada a rodopsina después de añadir retinal exógeno. Por lo contrario, el mutante N55K no regenera, lo que indica que los mutantes actúan con diferentes mecanismos, pudiéndose correlacionar este diferente comportamiento con los fenotipos clínicos específicos de cada mutante. Las interacciones entre la rodopsina y arrestina, y entre M3R y tau, han estudiado para entender el mecanismo funcional de las enfermedades degenerativas de RP y AD respectivamente. La unión de rodopsina activa con el mutante de arrestina R175E, ralentiza la liberación de retinal desde el sitio de unión. Estudios futuros de esta interacción con mutantes asociados a RP ayudarán a explorar los mecanismos de terminación de señal visual, y su conexión con las degeneraciones retinanas aspecto no muy estudiado hasta el momento. M3R desempeña funciones sobre la transmisión de la señal del muscarínico ACh y los canales ionicos, especialmente en el sistema nervioso central (SNC). Por otro lado, la interacción de M3R WT y los mutantes N132G y D518N, produce un cambio en la localización de tau desde el citoplasma a la membrana cuando se coexpresan en células HEK293T. Además, los mutantes M3R D518K y K523Q también son afectados cuando se coexpresan pasando de la membrana al citoplasma. Estos cambios en las localizaciones celulares tanto de tau como del receptor sugieren interacciones específicas entre ellos. Estos resultados proporcionan claves importantes sobre los sitios de unión de tau y M3R, así como la posible implicación de este complejo en la AD. En general, las membranas artificiales de DMPC/DHPC y DDHA-PC, proporcionan un mejor entorno para estabilizar la rodopsina WT y los mutantes asociados a RP. Las diferentes propiedades obtenidas de los mutantes G90V y N55K en estas membranas artificiales pueden estar asociadas a sus distintos fenotipos clínicos específicos. Por otra parte, los resultados obtenidos en el estudio de las interacciones entre los GPCR y otras proteínas proporcionan una base adicional a los estudios asociados a enfermedades degenerativas.