Paràsits de mol·luscs bivalves a les Illes Balears: Detecció de Marteilia refringens i Perkinsus mediterraneus mitjançant tècniques moleculars

Abstract

Una de les principals limitacions a la que s‘enfronta la producció de mol·luscs bivalves és la prevenció i control de malalties, que es dispersen, principalment, pel moviment d‘estocs. A les Balears, hem trobat paràsits de bivalves poc patogènics com Bucephalus haimeanus, Mytilicola intestinalis, i metacercàries de tremàtodes. També altres que suposen un risc per a la producció, com Marteilia refringens, Perkinsus mediterraneus i P. olseni. La presència de M. refringens és una greu amenaça, doncs produeix desordres fisiològics que poden matar l‘hoste. Probablement, als anys 80, la desaparició dels bancs ostrícoles va ser causada per aquesta malaltia. Els musclos també són susceptibles a la infecció per M. refringens, però són resistents a la malaltia. L‘any 2004, es va detectar una mortalitat al banc de la rossellona (Chamelea gallina) de s‘Arenal de Palma de Mallorca. Per detectar l‘espècie causant de la malaltia es va recórrer a tècniques histològiques, hibridació in situ, PCR i PCR niada. La seqüència obtinguda a partir d‘un bloc de parafina va mostrar un 99,1 % de similitud amb les M. refringens tipus O. D‘aquesta manera es va concloure que l‘agent etiològic era M. refringens i posteriorment que la prevalença era del 55,1%. La ubicació específica de les cèl·lules de Marteilia refringens en els teixits de la rossellona es va determinar per hibridació in situ, trobant totes les fases conegudes, inclosa la d‘esporulació, el que demostra que el paràsit completa la infecció a la rossellona. Perkinsus mediterraneus infecta a una gran varietat de mol·luscs bivalves a l‘arxipèlag balear: Ostrea edulis, Mimachlamys varia, Arca noae, Chamelea gallina, Pinna nobilis i Venus verrucosa, sense mortalitats associades a aquest paràsit. Perkinus olseni sols s‘ha detectat en V. verrucosa, però en el present estudi no l‘hem trobat. La recerca de Perkinsus spp. s‘ha realitzat mitjançant RFTM i la determinació de l‘espècie per PCR-RFLP i seqüenciació. La prevalença de P. mediterraneus ha estat semblant a la d‘altres espècies de Perkinsus i la dinàmica de la seva infecció es semblant a la de P. marinus en la badia de Chesapeake, amb valors màxims de detecció del paràsit al setembre i octubre, després del màxim estival de temperatura, i regressió de la infecció a l‘hivern. Hem trobat 12 haplotips de P. mediterraneus amb una elevada similitud genètica. Les diferències es fan majors en incloure seqüències procedents de la bases de dades del GenBank, augmentant el nombre d‘haplotips a 24. Les anàlisis filogenètiques han detectat, en conjunt, tres grups diferents d‘O. edulis de Menorca, que es diferencien d‘altres llinatges coespecífics. Les anàlisis recolzen aquesta diferenciació entre les poblacions de Menorca i Mallorca, la qual sembla, en bona part deguda a l‘aïllament geogràfic del port de Maó. Malgrat això, altres factors, com la variabilitat ambiental, diferents localitats i dates de detecció, la translocació d‘animals, l‘activitat humana, etc, poden tenir certa influència. Al Mediterrani occidental es troben tres espècies de Perkinsus. Malgrat que es coneix que es produeixen co-infeccions a l‘escopinya gravada del port de Maó amb P. olseni i P. mediterraneus, no hem trobat cap cas, ni tampoc bivalves afectats per P. chesapeaki, espècie que s'ha trobat al delta de l'Ebre. A diferents mostreigs de C. gallina hem detectat la presència de M. refringens i P. mediterraneus. Encara que no hem trobat co-infecció, aquesta no es pot descartar, perquè els individus són molt joves i possiblement ambdós patògens estiguin a fases inicials d‘infecció.Tenint en compte que l‘esporulació de M. refringens s‘inicia quan la temperatura de l‘aigua és de 17ºC (mes de maig), que les zoospores de P. mediterraneus apareixen més tard (setembre-octubre) i que les mortalitats es detecten al juny-juliol, és més probable que la causa de la mortalitat sigui la marteiliosi.

Una de las principales limitaciones a la que se enfrenta la producción de moluscos bivalvos es la prevención y control de enfermedades, dispersadas, principalmente, por movimiento de partidas. En las Baleares, hemos encontrado parásitos de bivalvos poco patogénicos como Bucephalus haimeanus, Mytilicola intestinalis y metacercarias de tremátodos. También otros que suponen un riesgo para la producción, como Marteilia refringens, Perkinsus mediterraneus y P. olseni. La presencia de M. refringens es una grave amenaza, pues produce desórdenes fisiológicos que pueden matar al huésped. Probablemente, en los años 80, la desaparición de los bancos ostrícolas fue causada por esta enfermedad. Los mejillones también són susceptibles a la infección por M. refringens, pero són resistentes a la enfermedad. En 2004, se detectó una mortalidad en el banco de la chirla (Chamelea gallina) de s‘Arenal de Palma de Mallorca. Para detectar la especie causante de la enfermedad se recurrió a técnicas histológicas, hibridación in situ, PCR y PCR anidada. La secuencia obtenida a partir de un bloque de parafina mostró un 99,1% de similitud con M. refringens tipo O. De esta manera se concluyó que el agente etiológico era M. refringens y posteriormente, que la prevalencia era del 55,1%. La ubicación específica de las células de Marteilia refringens en los tejidos de la chirla se determinó por hibridación in situ, encontrando todas las fases conocidas, incluida la de esporulación, lo que demuestra que el parásito completa la infección en la chirla. Perkinsus mediterraneus infecta a una gran variedad de moluscos bivalvos en el archipiélago balear: Ostrea edulis, Mimachlamys varia, Arca noae, Chamelea gallina, Pinna nobilis y Venus verrucosa, sin mortalidades asociadas a este parásito. Perkinsus olseni sólo se ha detectado en V. verrucosa, pero en el presente estudio no lo hemos encontrado. La búsqueda de Perkinsus spp. se ha realizado mediante RFTM y la determinación de la especie por PCR-RFLP y secuenciación. La prevalencia de P. mediterraneus ha sido similar a la de otras especies de Perkinsus y la dinámica de su infección es similar a la de P. marinus en la bahía de Chesapeake, con valores máximos de detección del parásito en septiembre y octubre, después del máximo estival de temperatura, y regresión de la infección en invierno. Hemos encontrado 12 haplotipos de P. mediterraneus con una elevada similitud genética. Las diferencias se hacen mayores al incluir secuencias procedentes de la bases de datos del GenBank, aumentando el número de haplotipos a 24. Los análisis filogenéticos han detectado, en conjunto, tres grupos diferentes de O. edulis de Menorca, que se diferencian de otros linajes coespecíficos. Los análisis apoyan esta diferenciación entre las poblaciones de Menorca y Mallorca, la cual parece, en buena parte debida al aislamiento geográfico del puerto de Mahón. Sin embargo, otros factores, como la variabilidad ambiental, diferentes localidades y fechas de detección, la translocación de animales, la actividad humana, etc, pueden tener cierta influencia. En el Mediterráneo occidental se encuentran tres especies de Perkinsus. Aunque se conoce que se producen coinfecciones en la escupiña grabada del puerto de Mahón con P. olseni y P. mediterraneus, no hemos encontrado ningún caso, ni tampoco bivalvos afectados por P. chesapeaki, especie que se ha detectado en el delta del Ebro. En diferentes muestreos de C. gallina hemos detectado la presencia de M. refringens y P. mediterraneus. Aunque no hemos encontrado coinfección, ésta no se puede descartar, porque los individuos són muy jóvenes y posiblemente ambos patógenos estén en las fases iniciales de infección. Teniendo en cuenta que la esporulación de M. refringens se inicia cuando la temperatura del agua es de 17ºC (mes de mayo), que las zoosporas de P. mediterraneus aparecen más tarde (septiembre-octubre) y que la mortalidad se detecta en junio-julio, lo más probable es que la causa sea la marteiliosis

One of the main issues in bivalve mollusc production is the prevention and control of diseases, scattered mainly by stock movements. In the Balearic Islands, we found low pathogenic bivalve parasites as Bucephalus haimeanus, Mytilicola intestinalis and trematode metacercariae. Furthermore, we found others that are a threat for their welfare, like Marteilia refringens, Perkinsus mediterraneus and P. olseni. M. refringens is a serious threat, because it causes physiological disorders that could kill the host. Presumably, in the 80s, this disease was the agent of oyster banks die out. Mussels are susceptible to the infection, but they are resistant to the disease. Mass mortality was detected in 2004 at the striped Venus shell (Chamelea gallina) bed in S‘Arenal beach. We use histological techniques, in situ hybridization, PCR and nested PCR to detect the disease agent. From a paraffin block we retrieved a sequence which showed 99.1% similarity with M. refringens type O. Thus, it was concluded that the aetiological agent was M. refringens. Subsequently, we found a prevalence of 55.1%. Marteilia refringens specific location in striped Venus shell tissues was determined by in situ hybridization. We observed all known stages, including sporulation, thus this parasite could complete its vital cycle in C. gallina, and so striped Venus shell should be considered as a new host of M. refringens. A wide bivalve mollusc variety is infected by Perkinsus mediterraneus in Balearic Islands: Ostrea edulis, Mimachlamys varia, Arca noae, Chamelea gallina, Pinna nobilis and Venus verrucosa, but they are not killed by this parasite. Perkinsus olseni has only been detected in V. verrucosa from Mahon harbour, although we have not detected it in another bivalve species. Perkinsus spp. search was performed using RFTM and species was established by PCR-RFLP and sequencing. P. mediterraneus prevalence was similar to other Perkinsus species and their infection dynamics is like P. marinus’ in Chesapeake Bay, with maximum detection values in September and October, after summer peak temperature with infection regression in winter. We have found 12 P. mediterraneus haplotypes, all of them sharing a high similarity. Differences grow up when we added GenBank sequences. Then, the haplotype number raised 24. Three groups of O. edulis from Minorca were revealed by phylogenetic analyses which are different from other co-specifics lineages. Analysis supported this differentiation among populations from Minorca and Majorca. This differentiation could be due to Mahon harbour geographic isolation. Nevertheless, another factors, such environmental variability, different detection locations and dates, animal translocations, human activity, etc., might also have some influence. There are three Perkinsus species at the western Mediterranean. Although it is known that co-infections between P. olseni and P. mediterraneus can happen in warty Venus shell from Mahon harbour, we have not found any occurrence. Furthermore, we have not detected infection by P. chesapeaki, although it has been found in the Ebro delta. We have found out M. refringens and P. mediterraneus presence in different C. gallina samples. Although coinfection has not been found, we cannot discard it, because individuals are very young and perhaps both pathogens are in early infection stages. Given that M. refringens sporulation starts when water temperature is 17ºC (May), P. mediterraneus zoospores appear later (September-October) and mortality is detected in June-July, in this way, marteiliosis might be the candidate.