Noves aproximacions per a la detecció de microorganismes patògens

Abstract

Aquesta tesi s'ha focalitzat en el desenvolupament de noves eines immunoquímiques per al diagnòstic de malalties infeccioses amb l'objectiu d'incrementar l'eficiència dels actuals mètodes de diagnòstic. Concretament, aquesta tesi s'ha centrat en el desenvolupament de tècniques immunoquímiques per a la detecció de Staphylococcus aureus i Pseudomones aeruginosa en mostres biològiques. L'estratègia ha consistit a seleccionar dianes específiques de cadascun dels microorganismes i, mitjançant el disseny racional d'haptens d'immunització, desenvolupar anticossos policlonals específics. Els anticossos han estat avaluats mitjançant assajos de tipus ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) i posteriorment s'han implementat en immunoassajos ELISA en microplaca o de micromatrius (microarrays) fluorescents per a l'anàlisi de mostres biològiques (bacteris en medi de cultiu) i mostres clíniques d'origen respiratori (esput, rentats broncoalveolars i broncoaspirats). Els immunoassajos obtinguts per ambdós bacteris són capaços de detectar les dianes seleccionades amb nivells de detecció útils per a la seva implementació en l'àmbit de diagnòstic, oferint una alternativa prometedora al diagnòstic de malalties causades per aquests bacteris.

Com a resultat de la investigació realitzada, s'han generat dues patents (PCT/ES2014/070161 i P201530780), les quals es troben en fase de negociació amb empreses de l'àmbit del diagnòstic. A més s'ha publicat un article de revisió que descriu l'estat de la qüestió pel que fa al potencial de la nanobiotecnologia en el diagnòstic de microorganismes patogen, un article de recerca original, que ja ha estat publicat en la revista Analytica Chimica Acta i que descriu el treball realitzat pel que fa a la detecció immunoquímica de S. aureus, i un tercer article que es troba sota avaluació pels revisors i editors de la revista Analytical Chemistry i que reporta la recerca realitzada pel que fa al desenvolupament d'eines immunoquímiques per al diagnòstic de malalties causades per P. aeruginosa. Per aquest motiu, la tesi s'ha estructurat en format de compendi de publicacions.

La tesi també inclou un annex fruit d'una estada predoctoral al grup del Prof. Kim Janda de The Scripps Research Institute (TSRI, CA, EEUU). L'objectiu de l'estada era l'avaluació com a eines terapèutiques dels anticossos produïts en aquesta tesi contra la P. aeruginosa. En aquest sentit, es pretenia investigar el potencial dels anticossos generats per neutralitzar els efectes citotòxics causats per factors de virulència d'aquest microorganisme sobre línies cel•ulars de macròfags. Tot i l'interès d'aquests estudis, aquest treball no es va poder concloure, i no es descarta reprendre'l més endavant.

This thesis has focused on the development of immunochemical new tools for the diagnosis of infectious diseases with the aim of increasing the efficiency of current diagnostic methods. Specifically, this work has focused on the development of immunochemical techniques for the detection of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa in biological samples. The strategy consisted in selecting specific targets for each of the microorganisms and, specific polyclonal antibodies were developed through rational design of immunization haptens. The antibodies were evaluated by ELISA tests (enzyme-linked immunosorbent assay) and later implemented in microplate ELISA immunoassays and fluorescent microarrays for the analysis of biological samples (bacteria in culture medium) and clinical samples of respiratory origin (sputum and broncoalveolars lavages and broncoaspirats). The immunoassays obtained for both bacteria are capable of detecting the selected targets with detection levels useful for its implementation in the diagnosis field, offering a promising alternative for diagnosing diseases caused by these bacteria.

As a result of the research carried out two patents have been generated (PCT/ES2014/070161 and P201530780), which are under negotiation with companies in the field of diagnosis. It has published a review article that describes the state of the art regarding the potential of nanobiotechnology in the diagnosis of pathogenic microorganisms, an original research paper, which was published in the Analytica Chimica Acta journal describing the work regarding the immunochemistry detection of S. aureus, and a third article that is under evaluation by the reviewers and editors of the Analytical Chemistry journal and reporting research conducted regarding the development of immunochemistry tools to diagnose diseases caused by P. aeruginosa.