Efectos de la interacción de compuestos de cobre(II) y rutenio(II) con fibronectina y tubulina: proteínas relacionadas con los procesos químicos del cáncer

Abstract

Los esfuerzos actuales de investigación en búsqueda de nuevos fármacos antineoplásicos basados en metales están dirigidos a la evaluación de su interacción con la doble hélice del ADN, teniendo en cuenta que este es el mecanismo de acción aceptado para el cisplatino medicamento quimioterapéutico utilizado con éxito para el tratamiento de varios cánceres desde hace unas cuantas décadas. Sin embargo, este enfoque ignora con frecuencia el hecho de que otros componentes celulares pueden ser el blanco de diferente complejos metálicos [1]. En el presente estudio, la fibronectina y la tubulina, proteínas implicadas en procesos celulares fundamentales como la división celular y la migración celular [2], han sido elegidos como dianas de la posible interacción con los compuestos RC8 ([RuIICl(p-cimeno)(1,10-fenantrolina-5,6-diona)][PF6]), CasIII-Ea [Cu(4,7-dimethyl-1,10-fenantrolina)(acetil-acetonato)]NO3), C1(Cu R(sal-L-phen)(phen)), C2(Cu(Sal-Gly)(bipy)) y C3(Cu(Sal-Gly)(phen).

La interacción de los compuestos escogidos con las proteínas fibronectina, tubulina y el ADN fueron evaluadas en una primera etapa de la investigación utilizando dicroísmo circular (DC) y microscopía de fuerzas atómicas (AFM). También se han realizado ensayos de MTT para determinar las actividades inhibidoras de crecimiento celular (IC50) de los compuestos en líneas celulares HL60 y HeLa. A continuación se llevaron a cabo pruebas de inmunofluorescencia con los cinco complejos que presentaron los mejores índices de citotoxicidad, en células Hela, utilizando, anti-α-anti-β-tubulina y anti-fibronectina anticuerpos para investigar su efecto sobre los microtúbulos y la matriz extracelular. Se utilizaron los agentes comerciales Nocodazole, taxol y Cisplatino, para comparar los mecanismos de acción de los compuestos evaluados.

Se ha observado que en los experimentos de AFM y DC se evidencia claramente la interacción de los compuestos con ambas proteínas y el ADN, siendo la casIII-E la que presenta una mayor agresividad. Por otra parte, los ensayos de inmunofluorescencia revelaron un comportamiento despolimerizante de los microtúbulos similar al provocado por el nocodazole en los tratamientos con los compuestos C1, C3 y CasIII-E y la formación de núcleos apoptóticos para todos los compuestos. Por último las imágenes obtenidas con el compuesto RC8 confirman la idea inicial que se tenía de que su acción es a través de la matriz de metaloproteínas.

Las pruebas del ciclo celular no mostraron una detención en la fase G2, que habría indicado estabilización de los microtúbulos (que impide la división celular), por el contrario sugerían que las células habían muerto por apoptosis, es decir una muerte limpia, lo cual se confirmó en los ensayos de anexina, aunque en comparación con el cisplatino el porcentaje de células que se encuentran en apoptosis tardía es más alto de lo esperado, lo que quizás se deba a una dinámica de acción más lenta.

Como conclusión: la fibronectina y la tubulina son proteínas diana legítimas de potenciales fármacos contra el cáncer basados en metales tales como los compuestos evaluados en la presente Tesis, los cuales mostraron actividad citotóxica apoptótica.

Current research efforts in finding new metal-based anti-cancer drugs are aimed at evaluating their interaction with the double helix of DNA, considering that this is the mechanism of action accepted for the chemotherapy drug cisplatin used successfully for treatment of various cancers for several decades. However, this approach often ignores the fact that other cell components may be the target of different metal complexes [1]. In the present study, fibronectin and tubulin proteins involved in fundamental cellular processes such as cell division and cell migration [2] have been chosen as targets of possible interaction with compounds RC8 ([RuIICl (p-cymene) (1,10-phenanthroline-5,6-dione)] [PF6]), CasIII-Ea [Cu (4,7-dimethyl-1,10-phenanthroline) (acetylacetonate)] NO3), C1 (Cu R (sal-L-phen) (phen)), C2 (Cu (Sal-Gly) (bipy)) and C3 (Cu (Sal-Gly) (phen). The interaction of the selected compounds with fibronectin and tubulin proteins and DNA were evaluated in an initial stage of research using circular dichroism (CD) and atomic force microscopy (AFM). MTT assays were also conducted to determine the cell growth inhibitory activities (IC50) of the compounds in HeLa and HL60 cell lines. Following this, tests were conducted with the five immunofluorescence complexes which showed the best indicators of cytotoxicity, in Hela cells using anti-α-anti-β-tubulin and anti-fibronectin antibodies to investigate its effect on microtubules and extracellular matrix. Nocodazole commercial agents, taxol and cisplatin were used to compare the mechanisms of action of the compounds tested.

In AFM and CD experiments a clearly evident interaction of the compounds with both proteins and DNA was observed, with casIII-E showing a greater aggressiveness. Furthermore, immunofluorescence assays revealed a de-polymerizing behavior of the microtubules similar to that caused by nocodazole treatments with C1, C3 and CasIII-E compounds and formation of apoptotic nuclei for all of the compounds. Finally the images obtained with the RC8 compound confirmed the initial idea that their action is through the matrix of metalloproteins.

The cell cycle tests did not show an arrest in the G2 phase, which would have indicated stabilization of the microtubules (which prevents cell division). To the contrary, they suggested that the cells had died by apoptosis, ie a clean death, which is confirmed in trials of annexin, although in comparison to cisplatin the percentage of cells found in late apoptosis is higher than expected, which may be due to a slower dynamic action.

In conclusion: fibronectin and tubulin are legitimate target proteins of potential anti-cancer drugs such as the metal-based compounds evaluated in this thesis, which showed cytotoxic apoptotic activity.