Identificación y caracterización de genes regulados por NOR-1 (Neuron-derived Orphan Receptor-1): implicación en el remodelado vascular y la diferenciación celular

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares constituyen la primera causa de muerte a nivel mundial. El común denominador de las enfermedades cardiovasculares de componente isquémico es la aterosclerosis. La complicación trombótica de las placas ateroscleróticas puede ocasionar eventos clínicos como el infarto agudo de micardio o los accidentes cerebrovasculares. En la evolución de esta patología juegan un papel clave las células musculares lisas de la pared vascular, que experimentan cambios importantes en su fenotipo y en su patrón de expresión génica. En la regulación de dichos cambios participa la familia de receptores nucleares NR4A. Los receptores NR4A (NOR-1, Nurr1 y Nur77) están codificados por genes de respuesta temprana, cuya expresión se induce por estímulos mitogénicos, pro-inflamatorios y pro-aterogénicos. Nuestro grupo identificó a NOR-1 (NR4A3) como un factor de transcripción implicado en la cardiopatía isquémica y en la migración, la proliferación y la supervivencia de las células vasculares. Actualmente se desconoce la identidad de la mayoría de los genes diana de NOR-1. Los objetivos principales de este proyecto fueron la identificación de genes regulados por NOR-1 a nivel vascular y la caracterización de los mecanismos moleculares por los cuales este receptor regula su expresión.

En estudios de expresión génica diferencial en células musculares lisas que sobre-expresaban los receptores NR4A, identificamos un conjunto de genes cuya expresión se modulaba significativamente. Mediante diferentes estrategias confirmamos a MYOM1, A2M y SMPX como potenciales genes diana de NOR-1. MYOM1 codifica para la miomesina 1, una proteína implicada en la contracción de las fibras musculares. La alfa-2 macroglobulina (A2M) es una anti-proteinasa de amplio espectro presente en el plasma de los vertebrados. La regulación de A2M tiene lugar mediante la unión de los receptores NR4A a un elemento NBRE presente en su promotor. Los receptores NR4A modulan la actividad de las metaloproteinasas MMP-2 y MMP-9 a través de diferentes mecanismos, entre ellos mediante la inducción de la expresión de A2M. Además evidenciamos que la A2M se expresa de forma relevante en las células musculares de la capa media de las arterias humanas. Por su parte, el gen SMPX (Small Muscle Protein X-linked) codifica para una proteína asociada al citoesqueleto que se expresa sobre todo en células de músculo esquelético y cardíaco. La regulación de SMPX por NOR-1 se produce a través de un elemento NBRE no canónico. La diferenciación de mioblastos humanos de músculo esquelético (HSMM) a miotubos incrementa la expresión y los niveles de SMPX de forma dependiente de NOR-1. El silenciamiento de NOR-1, pero no el de SMPX, inhibe el proceso de diferenciación de las células HSMM.

Cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide. Atherosclerosis is a common factor among ischemic cardiovascular disorders. Thrombotic complication of atherosclerotic plaques can cause clinical events such as acute myocardial infarction and strokes. Smooth muscle cells of the vascular wall play a key role in this pathology, experiencing significant changes in their phenotype and gene expression pattern during the course of the disease. The NR4A nuclear receptors family is involved in the regulation of such changes. The NR4A receptors (NOR-1, Nur77 and Nurr1) are encoded by early response genes, whose expression is induced by mitogenic, pro-inflammatory and pro-atherogenic stimuli. Our group identified NOR-1 (NR4A3) as a transcription factor involved in ischemic cardiopathy and in the migration, proliferation and survival of vascular cells. However, most of the genes targeted by NOR-1 are thus far unknown. Therefore, the main objectives of this project were to identify genes regulated by NOR-1 at the vascular level, and to characterize the molecular mechanisms by which this receptor regulates gene expression.

By studying the genes differentially expressed in smooth muscle cells overexpressing NR4A receptors, we identified a set of genes whose expression was significantly shifted. Among those genes, we confirmed MYOM1, A2M and SMPX as potential targets of NOR-1. MYOM1 encodes myomesin 1, a protein involved in the contraction of muscle fibers. Alpha-2-macroglobulin (A2M) is a broad spectrum anti-proteinase present in the plasma of vertebrates. A2M is regulated by NR4A receptor, through the binding to an NBRE element present in the A2M promoter. NR4A receptors modulate the activity of MMP-2 and MMP-9 metalloproteinases through different mechanisms, including the induction of A2M expression. Furthermore, we evidence that A2M is significantly expressed in muscle cells of human arteries. Regarding SMPX (Small Muscle Protein X-linked), it encodes a cytoskeleton-associated protein, specifically expressed in skeletal and cardiac muscle cells. SMPX regulation by NOR-1 occurs through a non-canonical NBRE element. The SMPX expression is increased in a NOR-1 dependent manner during the differentiation of human skeletal myoblasts (HSMM) to myotubes. Silencing of NOR-1, but not of SMPX, inhibits the differentiation of HSMM.