Insulators: estructura y funciones

Abstract

Los insulators son complejos de DNA y proteínas, cuya función no solo consiste en impedir la comunicación enhancer-promotor y/o bloquear la expansión del silenciamiento de la heterocromatina como clásicamente se habían descrito. Median interacciones intra e intercromosomales, cuyo objetivo fmal es la organización del genoma en diferentes dominios, regulando por consiguiente las funciones del DNA.

Uno de los objetivos de esta tesis fue la búsqueda de nuevas funciones de proteínas insulators ya conocidas. Observamos que, en Drosophila melanogaster, la carencia de la proteína insulator CTCF produce un retraso en el desarrollo. CTCF juega un papel esencial en la regulación de la expresión génica, y demostramos que es necesaria para la transcripción de los genes Halloween spookier, shadow y noppera-bo, involucrados en la biosíntesis de ecdisona en la glándula protorácica. Comprobamos que el retraso no se recupera con la mera adición de ecdisona al medio, sino que a la vez tiene que estar enriquecido en colesterol. Esto, junto con la acumulación anormal de lípidos en la glándula que produce la ausencia de CTCF, muestra que también es necesaria para la homeostasis de los lípidos.

Por otro lado, también estamos interesados en la caracterización de nuevas proteínas con actividad insulator. Analizamos la composición de los complejos que contienen CP190 (cofactor común de todos los insulators). De entre las proteínas que hemos identificado, Ibfl, Ibf2 y pita forman parte del mismo complejo, tienen actividad enhancer-blocking en los insulators del complejo Bithorax y, además, Ibfl e Ibf2 están presentes en los insulator bodies, requiriéndose mutuamente para formar parte de ellos.

También hemos realizado un screening para identificar proteínas con actividad enhancer-blocking, y nos decantamos por el estudio de Haspin. Además de bloquear la comunicación entre enhancer y promotor en el complejo Bithorax, actúa como modulador de la estructura, condensación y organización de la cromatina: su ausencia provoca fuertes alteraciones morfológicas de los núcleos interfásicos, observándose grandes invaginaciones, además de inducir la condensación. Asimismo, nuestros análisis muestran que la actividad kinasa de Haspin es necesaria para realizar estar funciones. Hasta el momento, H3T3 es su única diana conocida. Comprobamos que, en Drosophila, Haspin es la principal kinasa que produce esta marca, y que está presente tanto en mitosis como en interfase.

El análisis de la localización de H3T3ph a lo largo del genoma señala que está preferentemente en heterocromatina pericentromérica, así como en grandes regiones silenciadas ricas en lamina y H3K27me3, delimitadas por proteínas insulators. Nuestros resultados muestran también que Haspin es necesaria para la unión de Polycomb al complejo Bithorax.

Además confirmamos que Haspin necesita a pds5 (proteína que interactúa con el complejo de las cohesinas) para mediar su función, y que pds5 precisa de Haspin para unirse a la cromatina. Los efectos que genera la falta de Haspin son contrarios a los observados con la sobreexpresión de CapH2 (proteína del grupo de las condensinas II), y la condensación que produce la ausencia de Haspin podría deberse a una unión excesiva de CapH2 al DNA. De hecho, su localización parece incompatible con la presencia de H3T3ph. Durante mitosis y meiosis existe una relación Haspin-pds5-cohesinas-condensinas y nuestros resultados indican que esta relación existe también en interfase y juega un papel importante en la organización de la cromatina dentro del núcleo.

Current knowledge about insulator function suggests that their main activity is to control intra and interchromosomal interactions, in order to organize the genome in different domains, and so, regulate DNA functions.

In this thesis we looked for new roles of already known insulator proteins. We show that CTCF regulates Drosophila melanogaster developmental time. We demonstrate that this protein regulates ecdysone signalling in two ways: it controls expression levels of spookier, shadow and noppera-bo (some of the Halloween genes required for ecdysone byosinthesis) and it regulates lipid homeostasis in the cells that produce the hormone.

We also characterized new insulator proteins by analysing protein complexes that contain CP190. We show that lbf1, lbf2 and pita are in the same complex, all of them being necessary for insulator activity in enhancer-blocking assays. Moreover, lbf1 and lbf2 overlap with CP190 at insulator body sites.

On the other hand, we performed a screening in Drosophila looking for proteins with insulator activity and we identified the kinase Haspin. We report that it is essential for chromatin organization since Haspin null mutations show strong morphological alterations and interphase nuclear condensation. These effects are mediated by its kinase domain and we also show that Haspin is the main kinase that phosphorylates H3T3 in Drosophila both, in mitosis and interphase. H3T3ph genome localization is mainly pericentromeric and in big silenced regions, enriched in lamin and H3K27me3, and flanked by insulator proteins. Our results also show that Haspin is needed for Polycomb binding to the Bithorax complex.

Finally, we also show that pds5, a protein which interacts with cohesin complex, needs Haspin to be chromatin associated. Moreover, H3T3ph and CapH2 (protein of the Condensin II complex) genome localization are mutually exclusive. A relationship between Haspin-pds5-cohesin-condensin has been previously reported during mitosis and meiosis, and our results indicate that this relationship also exists in interphase playing an important role in chromatin organization.